Chúng tôi đã thiết kế ba cặp mồi để nhân bản ba trình tự DNA từ gene pbp2b với kích thước là 331bp, 130bp, 242bp. Các trình tự DNA có kích thước khoảng 300 bp được xem là phù hợp cho phương pháp phân tích SSCP.

Trước tiên, chúng tôi so sánh ba tác nhân biến tính: nhiệt (nước đun sôi), formamide và NaOH. Kết quả cho thấy phương pháp biến tính bằng nhiệt cho kết quả tốt nhất. Ðiều này thể hiện qua cường độ và mức độ phân tách của các vạch tương ứng với mạch đơn DNA.

Khi khảo sát hai phương pháp phát hiện DNA trên gel sau điện di: nhuộm ethidium bromide và nhuộm bạc. Kết quả cho thấy phương pháp nhuộm bạc có độ nhạy cao hơn.

Kết quả khảo sát hàm lượng mẫu DNA sử dụng cho điện di SSCP cho thấy: hàm lượng 2880ng là thích hợp cho việc phát hiện bằng phương pháp nhuộm bạc. Do đó, chúng tôi sử dụng nồng độ DNA này cho các khảo sát về sau.

Chỉ tiêu cuối cùng được khảo sát là tiû lệ bisacrylamide : acrylamide dùng để tạo gel. Kết quả khảo sát các tỉ lệ 1: 39, 1: 59, 1: 79, 1: 99,
1: 149 đối với gel 8 cho thấy tiû lệ 1: 39 cho kết quả phân tách hai mạch đơn DNA tốt nhất đối với các trình tự DNA nghiên cứu.

Chúng tôi sử dụng quy trình SSCP với các điều kiện đã chọn để phát hiện đột biến điểm trên ba trình tự DNA thuộc gen pbp2b của 21 chủng S. pneumoniae gồm 1 chủng nhạy và 20 chủng kháng.

Trong phương pháp SSCP, người ta có thể phát hiện đột biến điểm trên một trình tự DNA chưa biết khi so sánh dạng điện di của trình tự ấy (dưới dạng mạch đơn) với một trình tự chứng đã biết. Trong khảo sát của chúng tôi, các trình tự chứng được nhân bản từ gen pbp2b của chủng S. pneumoniae nhạy với penicillin (ATCC 49619).

Sau đây là bảng tổng kết kết quả điện di SSCP trên 3 trình tự khảo sát:

Một số công trình nghiên cứu cho thấy nhiều đột biến trên gen pbp2b có ảnh hưởng rất lớn đến tính kháng penicillin ở Streptococcus pneumoniae. Mức độ kháng penicillin của 20 chủng S. pneumoniae kháng penicillin mà chúng tôi khảo sát có MIC đối với penicillin > 4mg/ml. Nồng độ này tương ứng với mức độ kháng cao. Kết quả điện di SSCP phù hợp với kết quả trên: có 18/20 chủng kháng có dạng điện di khác với chủng nhạy ATCC, nghĩa là có khả năng mang những sai khác trên trình tự nucleotide so với chủng nhạy. Hai chủng kháng còn lại (33, 34) có dạng SSCP giống hệt chủng nhạy. Có thể đột biến dẫn đến tính kháng penicillin ở hai chủng này xảy ra bên ngoài khu vực trình tự khảo sát. Ngoài ra, độ nhạy của phương pháp SSCP cũng không cho phép phát hiện quá 70-80% số đột biến tồn tại.

Kết quả điện di SSCP cho thấy 18/20 chủng khảo sát đều có mang đột biến trên ít nhất 1 trong ba trình tự 1, 2, 3 của gen pbp2b. Cả ba trình tự này nằm trong vùng tương ứng với vùng mã hóa cho hoạt tính transpeptidase (TER: transpeptidase encoding region) của gen pbp2b là vùng có biến động rất lớn về mặt di truyền^(1,2,4). Theo một số công trình nghiên cứu, thì những thay đổi trên gen pbp2b quan trọng chủ yếu tập trung ở khu vực này. Như vậy, kết quả chúng tôi nhận được phù hợp với nhận định trên. Do vùng gen khảo sát trong đề tài này chỉ chiếm hơn 1/3 vùng TER nên có khả năng 2 chủng kháng 33, 34 có mang đột biến nằm ngoài khu vực khảo sát như đã nói ở trên.

Như vậy, quy trình SSCP hình thành đã cho phép phát hiện được các sai khác trên trình tự nucleotide nằm trong gen pbp2b. Các sai khác này có thể có liên quan đến tính kháng penicillin ở S. pneumoniae.

Quy trình SSCP với các điều kiện được xác định bao gồm: biến tính DNA bằng nhiệt, phát hiện sau điện di bằng phương pháp nhuộm bạc, hàm lượng DNA sử dụng là 2880ng, tỉ lệ bisacrylamide : acrylamide trong gel 8% là 1 : 39 .

Sử dụng quy trình này để phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên 3 trình tự DNA nhân bản từ gene pbp2b ở 20 chủng S. pneumoniae kháng penicillin và 01 chủng nhạy ATCC49619, chúng tôi nhận thấy có 18/20 chủng kháng có mang những sai khác trên ít nhất 1 trong ba trình tự khảo sát.

1. ANTHONY M. SMITH & KEITH P. KLUGMAN. 1995. Alteration in penicillin binding protein 2B from penicillin-resistant wild-type strains of Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial agents and chemotherapy. 39: 859-867.
2. KIMIKO UBUKATA, YASUKO ASAHI, AKIO YAMANE & MASATOSHI KONNO. 1996. Combination detection of autolysin and penicillin binding protein 2B gene of Streptococcus pneumoniae by PCR. Journal of clinical microbiology. 34: 592-596.
3. LAWRENCE E. BRYAN, ALLAN J. GODFREY. 1991. b lactam antibiotics: Mode of action and bacterial resistance. Antibiotics in Laboratory medicine. William & Wilking. 3^th ed: 599-620
4. LÊ ÐẶNG HÀ, LÊ HUY CHÍNH, LÊ VĂN PHỦNG, PHẠM VĂN CA. Một số kết quả của chương trình giám sát quốc giavề tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh thường gặp năm 1999. NXB Y học. Tháng 4/2201. Số 5.