Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là vấn đề lớn, mang tính toàn cầu trong lĩnh vực sức khỏe con người. Cơ chế kháng chủ yếu dựa trên sự biến đổi cấu trúc các PBP (Penicillin Binding Protein) mà quan trọng nhất là PBP1A, 2B, 2X mã hóa bởi các gene pbp tương ứng. Kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism - Tính đa hình trong cấu hình mạch đơn của nucleic acid) là một trong những kỹ thuật thông dụng cho phép phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm trên một trình tự nucleic acid khi so sánh với trình tự chuẩn (không mang đột biến). Ðề tài áp dụng kỹ thuật SSCP để phát hiện đột biến trên 3 trình tự của gene pbp2b ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin.

Summary

USING SSCP (SINGLE S TRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) TECHNIQUE FOR DETECTION OF MUTATION OF PENICILLIN-RESISTANT STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE PBP2B GENE

Ðỗ Thanh Ngân, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Võ Thị Chi Mai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 6 - No 2 - 2002: 70 - 73

The spread of penicillin resistant strains of Streptococcus pneumoniae is an important worldwide health problem. Resistance is essentially based on the modification of PBPs (Penicillin Binding Proteins), particularly PBP1A, 2B and 2X, encoded by corresponding pbp genes. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) electrophoresis analysis is one of well-known techniques used to detect point mutations in DNA fragments. We used SSCP analysis for the detection of point mutations in 3 amplified fragments from pbp2b gene of resistant S. pneumoniae strains.

Sự phát triển và lan truyền của Streptococcus pneumoniae kháng penicillin là một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe trên thế giới. Tại Việt Nam, năm 1999, theo số liệu của chương trình Giám sát quốc gia về tính kháng thuốc của một số vi khuẩn thường gặp, có 13,7% chủng S. pneumoniae được xác định là kháng penicillin (trên 153 chủng khảo sát). Tỷ lệ này là con số đáng báo động⁽⁴⁾. Tình hình kháng thuốc của một số vi khuẩn ở người khỏe mạnh tại cộng đồng năm 1999 (tại ba địa điểm ngoại thành thành phố Hà Nội, Huế và TP. Hồ Chí Minh) cho thấy tỉ lệ mang vi khuẩn S. pneumoniae có độc lực ở người khỏe mạnh là 40,1% tại Hà Nội, 16,7% tại Huế và 30,9% tại Tp. Hồ Chí Minh. Mức độ nhạy cảm với penicillin của 153 chủng S. pneumoniae ở trẻ khỏe mạnh đã giảm đi 19,6% tính chung cho ba địa phương này⁽⁴⁾.

Nguyên nhân kháng penicillin ở S. pneumoniae là do sự thay đổi của các PBP (penicillin binding protein - phức hợp enzym acyl serine transferase xúc tác tạo các cầu peptide trong hình thành thành tế bào)⁽³⁾. Ở các chủng S. pneumoniae kháng penicillin, các PBP 1A, 2A, 2B và 2X là các PBP có khả năng thay đổi giảm ái lực với penicillin. Trong đó, sự thay đổi của PBP 2B có vai trò quan trọng. Hơn nữa, gene pbp2b mã hóa cho PBP 2B có tần số đột biến rất cao và đột biến xảy ra trên gene pbp2b cũng rất đa dạng^(1,2,3).

Trong các phương pháp phát hiện sự tồn tại các đột biến trên một trình tự DNA như: DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), CCM (Chemical Cleavage Method), EMC (Enzyme Mismatch Cleavage),... thì kỹ thuật SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) là kỹ thuật khá thông dụng. Kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn nucleic). Ðây là một phương pháp đơn giản để xác định đột biến điểm trên một trình tự DNA khi so sánh với một trình tự DNA đã biết. Nguyên tắc của kỹ thuật này là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt 1 nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide,

Chúng tôi khảo sát các điều kiện phân tách tối ưu cho kỹ thuật SSCP và sử dụng quy trình với các điều kiện đã xác định để phân tích các sai khác trình tự trên ba đoạn DNA nhân bản từ gene pbp2b của S. pneumoniae.

Sản phẩm DNA khảo sát là sản phẩm PCR của ba đoạn trình tự trên gen pbp2b của 20 chủng Streptococcus pneumoniae kháng penicillin và 1 chủng ATCC 49619.

DNA được biến tính bằng nhiệt (đun sôi 10 phút, làm lạnh đột ngột trong nước đá đang tan), formamide, NaOH 500mM. Các sản phẩm biến tính được phân tích trên gel polyacrylamide 8%. Ðiện di trong 16 giờ ở hiệu điện thế 100V. Phát hiện các sản phẩm trên gel sau điện di bằng cách nhuộm với dung dịch bạc 25% hoặc ethidium bromide.