Kỹ thuật miễn dịch men (ELISA) được nghiên cứu để chẩn đoán bệnh Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis) ở người. Kháng nguyên A. cantonensis ở nồng độ 3µg/ml gắn kết với kháng thể có trong huyết thanh chứng dương tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Phức hợp này được phát hiện bởi cộng hợp IgG thỏ kháng IgG người có gắn peroxydase với sự hiện diện của chất nền. Hiệu giá kháng thể của 4 trường hợp nhiễm Angiostrongylus cantonensis được ghi nhận từ 1/400 đến 1/ 6400; và 20 mẫu huyết thanh của nguời khoẻ mạnh có hiệu giá kháng thể giao động từ 1/50 đến 1/200. Phản ứng chéo được ghi nhận với Gnathostoma spinigerum (8/30 ca), Paragonimus sp. (4/15 ca) và Toxocara canis (2/12 ca). Kết quả thu được cho thấy kỹ thuật ELISA có thể ứng dụng vào chẩn đoán bệnh nhiễm Gnathostoma, tuy nhiên cần nghiên cứu thêm về phản ứng chéo và đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này.

SUMMMARY

DETECTION OF ANTIBODY OF ANGIOSTRONGYLUS CANTONENSIS BY ELISA

Lê Thị Xuân * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Special issue of Medical Research - Vol. 6 - Supplement of No 1 - 2002: 64 - 68

An ELISA for immunodiagnosis of Angiostrongyliasis using a crude extract of larvae of Angiostrongylus cantonensis as antigen and peroxydase labelled goat antihuman IgG in the indicator system was developed and evaluated. The ELISA antibody titres were found to range from 1/400 to 1/ 6400. At the titre of 1/400 and above positive results were observed in 100% of 4 parasitological confirmed and 12 eosinophilic meningo-encephalitis (EME) typical of angiostrongyliasis cases, 20 samples from healthy persons which had a titre from 1/100 to 1/200. IgG-antibodies from heterologous serum samples elicited a number of false positives (19/115) from three helminthic infections ie gnathostomiasis, paragonimiasis and toxocariasis. The results in the present study seem to be promising for the diagnosis of angiostrongyliasis. Cross reaction with other parasitic infections and the evaluation of sensitivity and specificity by this method are needed.

Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis) là một loại giun ký sinh ở phổi của chuột, đầu tiên được phát hiện trên chuột bởi Chen tại Canton vào năm 1935. Ở người, giun gây viêm não-màng não với sự gia bạch cầu toan tính, hoặc giun có thể đi vào mắt.

Trường hợp bệnh viêm màng não-não do A. cantonensis ở người đầu tiên được phát hiện bởi Nomura và Lin vào năm 1945 ở một bé trai tại Ðài Loan, hai tác giả trên đã tìm thấy 6 con giun trong dịch não tủy của bệnh nhân.

Bệnh phổ biến Viễn Ðông, một số đảo ở Thái Bình Dương, Ðông Nam Á, nhất là Ðài Loan, Nhật Bản, Thái Lan. Ởû Việt Nam, năm 1965, một trướng hợp viêm màng não-não nghi ngờ do A. cantonensis () và năm 1974 tác giả Phan Trinh và cs. đã báo cáo một trướng hợp viêm màng não-não ở người được phát hiện sau khi mổ tử thi Trong thời gian qua, có 2 trường hợp A. cantonensis chui vào mắt được phát hiện tại thánh phố Hồ Chí Minh. Và cũng có nhiều trường hợp viêm màng não-não tăng bạch cầu toan tính được ghi nhận ở các bệïnh viện trong thành phố Hồ Chí Minh, nhưng chưa có trường hợp nào được xác nhận vì không bắt được giun, và cũng không có xét nghiệm đặc hiệu nào để xác định chẩn đoán nguyên nhân

Bệnh được xác định khi bắt được giun trong dịch não tủy. Ðiều này hiếm khi thực hiện được. Vì vậy, trên thế giới, người ta đã nghiên cứu nhiều kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp nhưng đặc hiệâu như kỹ thuật huyết thanh miễn dịch được như là kết tủa, ngưng kết hồng cầu thụ động, ngưng kết latex, miễn dịch men, phóng xạ. Trong số đo,ù kỹ thuật miễn dịch men (ELISA) tỏ ra thích hợp hơn trong chẩn đoán các bệnh KST thường quy tại các phòng xét nghiệm, do ít tốn sinh phẩm, hoá chất, thao tác đơn giản và có thể tự động hoá được. Ngoài ra, kỹ thuậy này có thể phát hiện được kháng thể (AB-ELISA) và kháng nguyên luân lưu (AG-ELISA).

Với mục đích góp phần chẩn đoán bệnh nhiễm Angiostrongylus cantonensis ở người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật miễn dịch (ELISA) để phát hiện ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên A. cantonensis.

Kháng nguyên được điều chế từ aÁu trùng A. cantonensis, thu thập từ các loại ốc. Nồng độ protein trong dung dịch kháng nguyên được đo bằng phương pháp Lowry và cs. (1951), BSA được dùng làm chuẩn.

Chứng dương là mẫu gồm 4 huyết thanh, được lấy từ 3 bệnh nhân đã được xác định nhiễm A. cantonesis, và 1 mẫu huyết thanh của 1 bệnh nhân bị giun chui vào mắt.

Chứng âm là mẫu gồm 20 mẫu huyết thanh, được lấy từ những người lớn khoẻ mạnh, không có tiền sử viêm màng não-não, bạch cầu toan tính trong giới hạn bình thường, xét nghiệm phân, đàm, nước tiểu đều không tìm thấy ký sinh trùng (KST) trong thời điểm lấy máu.

Các mẫu huyết thanh của những bệnh nhân bị nhiễm các KST khác được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau.

Kỹ thuật ELISA gián tiếp (Engvall vàPerlmann, 1972) dùng phiến nhựa 96 giếng (Greiner, Ðức).

Các thành phần tham gia phản ứng được pha loãng ở các nồng độ:

Kháng nguyên: 1µg/ ml, 2,5 µg/ ml, 5 µg/ ml, 10 µg/ ml

Huyết thanh: 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 và 1/6400

Cộng hợp : 1/1000, 1/2000

1. Phủ 100 µl kháng nguyên đã được pha loãng trong dung dịch đệm Carbonate, 0,1 M, pH 9, 6 và ủ ở 37ºC trong 1 giờ, sau đó để ở 4ºC qua đêm.
2. Rửa các giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS- 0,005%Tween 20, 0,01M, pH 7,4 (PBS-Tween)
3. Cho 150 µl dung dịch BSA 1% vào mỗi giếng, ủ ở 37ºC trong 1 giờ.
4. Rửa các giếng 3 lần bằng dung dịch đệm PBS-Tween
5. Cho 100 µl huyết thanh đã pha loãng vào mỗi giếng, ủ ở 37ºC trong 1 giờ.
6. Rửa các giếng 5 lần bằng dung dịch đệm PBS-Tween.
7. Cho 100 µl cộng hợp đã pha loãng vào mỗi giếng, ủ ở 37ºC trong 1 giờ.
8. Rửa các giếng 5 lần bằng dung dịch đệm PBS-Tween.
9. Cho 100 µl TMB vào mỗi giếng, để trong vòng 30 phút.
10. Cho 100 µl H2SO4 2M vào để ngưng phản ứng.
11. Kết quả được đọc máy đọc ELISA tự động ở bước sóng 405 nm. Dương tính khi màu xuất hiện, âm tính không có màu.
12. Cộng hợp IgG thỏ kháng IgG người có gắn men peroxydase (Pasteur, Paris).
13. Chất nền là TMB (3,3’, 5,5’-tetramethyl-benzidine).