TÓM TẮT
Kỹ thuật EITB (enzyme-linkerd immunoelectrophotransfer blot) được nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán bệnh Gnathostoma spinigerum (G. spingerum). Kháng nguyên, điều chế từ ấu trùng giai đoạn 3 của G. spinigerum, được phân ly trong gel bằng kỹ thuật điện di. Các thành phần protein sau đó được chuyển qua màng Nitrocellulose bằng máy Transfer blot. Kết quả cho thấy kháng nguyên G. spinigerum phức tạp, gồm có hơn 20 thành phần khác nhau, có trọng lượng phân tử (TLPT) từ 21 đến 150 kD. Một số thành phần kháng nguyên này phản ứng với huyết thanh của người khỏe mạnh và những bệnh nhân nhiễm những loại ký sinh trùng khác. Nhưng chỉ huyết thanh của bệnh nhân đã được xác định nhiễm G. spinigerum có phản ứng với băng protein có TLPT 24 kD. Băng protein có TLPT 24kD này có thể là băng protein chuyên biệt của G. spinigerum, có thể để ứng dụng vào chẩn đoán miễn dịch bệnh do Gnathostoma ở người. Công trình cần được tiếp tục để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật này. Kết quả cho thấy kỹ thuật EITB có thể giải quyết được hiện tượng chéo mà kỹ thuật ELISA với kháng nguyên thô hay mắc phải.
SUMMARY
enzyme-linked
immunoelectrophotransfer blot (ELIB)
FOR IMMUNODIAGNOSIS OF HUMAN GNATHOSTOMIASIS
Le Thi Xuan * Special issue of Medical Research - Vol. 6 - Supplement of No 1 - 2002: 49 - 51
Sera from 6 patients with parasitologically confirmed gnathostomiasis and from 20 healthy adults were studied by sodium dodecyl-sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Immunoblot analysis for their reactivities against somatic extract of Gnathostoma spinigerum (G. spinigerum) third-stage larvae (L3). It was found that the L3 extract was highly complex comprising of more than 20 antigenic components. The relative molecular weight (MW) range from 21 kD to 150 kD, a few of which gave reactions with sera from the healthy controls and patients with others parasitic infections. A specific antigen of G. spinigerum with a molecular weight of 24 kD was found to react with all parasitologically confirmed patients. This 24 component is a potential diagnostic antigen for use in the immunodiagnosis of human gnathostomiasis. Cross-reaction with other parasitic infections and the evaluation of sensitivity and specificity by this method are needed.
Mở đầu
Chẩn đoán bệnh do Gnathostoma gặp nhiều khó khăn, thường không xác định được nguyên nhân, mà chỉ dựa vào các triệu chứng phù di chuyển ngoài da, và tiền căn có ăn các thủy sản không được nấu chín. Gần đây, nhờ ứng dụng các kỹ thuật miễn dịch học (ELISA) vào chẩn đoán bệnh Gnathostoma, nên đã có nhiều trường hợp được phát hiện và điều trị kịp thời. Tuy nhiên, do kháng nguyên của ký sinh trùng (KST) nói chung và của Gnathostoma nói riêng phức tạp và thường có những thành phần giống nhau hoặc gần giống nhau giữa các KST nên kỹ thuật miễn dịch dùng kháng nguyên thô sẽ cho nhiều dương giả do phản ứng chéo giữa các loài KST. Mục đích nghiên cứu của công trình này là điều chỉnh kỹ thuật EITB để phân tích kháng nguyên thô được điều chế từ ấu trùng G. spinigerum bằng điện di và xác định thành phần kháng nguyên đặc hiệu của G. spinigerum dựa theo trọng lượng phân tử. Ðây là một kỹ thuật cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đang được ưa dùng để chẩn đoán các bệnh ký sinh trùng ở các nước trên thế giới.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chứng dương gồm 6 mẫu huyết thanh lấy từ người bị nhiễm Gnathostoma spinigerum (1 trường hợp bắt được ấu trùng ở mắt, 5 trường hợp bắt được mầm bệnh ở da)
Chứng âm gồm có 10 mẫu huyết thanh được lấy từ những người khoẻ mạnh. Huyết thanh của những bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Gnathosotma. Huyết thanh của những người nhiễm các loại KST khác.
Kháng nguyên
Kháng nguyên được điều chế từ ấu trùng giai đoạn 3 G. spinigerum, thu thập từ các loài thủy sản. Ấu trùng được rửa nhiều lần với nước muối NaCl 0,09%, sau đó được đông khô và bảo quản ở -20C. Nồng độ protein trong huyền dịch kháng nguyên được đo bằng phương pháp Lowry và cs. (1951), albumine huyết thanh bò (BSA) được dùng làm chuẩn.
Phương pháp
Ðiện di được thực hiện với bình điện di đứng theo phương pháp Laemmli và Fabre (1973). Kháng nguyên được đun sôi ở 100° C trong dung dịch SDS và 2-mercaptoethanol trong vòng 3 phút, sau đó đuợc cho vào các giếng để điện di. Sau khi quá trình điện di đã hoàn tất, miếng gel sẽ được nhuộm với Xanh Coomassie brilliant R (Sigma). Kháng nguyên được phân ly trong gel thành những băng protein theo trọng lượng phân tử (TLPT) khác nhau và sẽ được chuyển qua màng Nitrocellulose (Bio-Rad Laboratory. Cali., USA) bằng máy lai chuyển (Bio-Rad Transblot). Sau đó, màng này sẽ được cắt ra thành từng thanh có bề ngang 5 mm, chúng sẽ được ủ trong huyết thanh đã nêu trên, để qua đêm trên một máy lắc với tốc độ nhỏ. Sau đó, rửa các thanh này 5 lần với PBS và ủ chúng với cộng hợp pha loãng 1/1000 (Dako, Ðan Mạch), để trên máy lắc trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửûa 5 lần như trên và nhuộm màu với 2,6-dichorophenol-indophenol trong vài phút và rửa lại bằng nước cất.