Trong thời gian khảo sát 6 tháng trên các đối tượng có tiêu chuẩn, triệu chứng đã nêu, chúng tôi thu nhận được 157 bệnh phẩm đáp ứng chọn lọc. Khảo sát sơ bộ phát hiện bào tử của chi Encephalitozoon bằng phương pháp nhuộm Weber và Calco-fluor, chúng tôi phát hiện 13 chủng (tỷ lệ như vậy là 8,3 %).

Chúng tôi phát hiện những dải màu vàng cam, kích thước sản phẩm PCR thu được khoảng 1200 bp, trùng với kích thước của chủng E. hellem chuẩn đại diện.

Mặt khác, chứng Âm với nước cất không cho thấy sự hiện diện vết DNA nào chứng tỏ không có ngoạïi nhiễm. Chứng nội với DNA ly trích từ tế bào MRC-5 không nuôi cấy Microsporidia cũng Âm chứng tỏ cặp mồi có tính đặc hiệu riêng cho Microsporidia (vì tế bào MRC-5 là tế bào người, Eukaryote bậc cao).

Chúng tôi thực hiện trên 13 chủng thu được ban đầu nhưng chỉ có kết quả trên 9 chủng hay 69,2 % với kích thước sản phẩm PCR vào khoảng 1150 bp. Cặp mồi cũng hoạt động tốt trên chủng đại diện E. cuniculi và E. intestinalis, sản phẩm PCR cũng vào khoảng 1150 bp. Song song đó, chúng tôi cũng chạy lại những chủng (+) để kiểm tra. Chứng Âm và chứng nội đều (-) chứng tỏ không ngoại nhiễm và mồi sử dụng có tính đặc hiệu.

Chúng tôi chỉ thực hiện trên các chủng đại diện, qua thí nghiệm hoạt động tốt trên cả 3 chủng đại diện E. hellem, E. cuniculi và E. intestinalis. Kích thước sản phẩm cũng vào khoảng 1150 bp. Chứng Âm và chứng nội cũng đều (-).

Chúng tôi chỉ thực hiện trên các chủng đại diện, qua thí nghiệm cho kết quả tốt trên cả 3 chủng đại diện E. hellem, E. cuniculi và E. intestinalis. Kích thước sản phẩm PCR vào khoảng 1350 bp. Ðiều này cho thấy mồi ngược MIC23-1r bắt cặp vị trí xa hơn mồi ngược Int580r về phiá gen LSU-rRNA. Chứng Âm và chứng nội đều (-) chứng tỏ không ngoại nhiễm và mồi sử dụng có tính đặc hiệu.

Chúng tôi chỉ khuếch đại được trên chủng đại diện E. cuniculi, ngoài ra cặp mồi này không hoạt động được trên chủng đại diện E. hellem và E. intestinalis, kích thước sản phẩm PCR vào khoảng 1350 bp. Chứng Âm và chứng nội đều (-) chứng tỏ không ngoại nhiễm và mồi sử dụng có tính đặc hiệu.

Chúng tôi chỉ có kết quả trên chủng đại diện E.hellem với kích thước sản phẩm khoảng 2150 bp. Các chủng đại diện E.cuniculi và E.intestinalis không cho kết quả. Chứng Âm và chứng nội đều (-) chứng tỏ không ngoại nhiễm và mồi sử dụng có tính đặc hiệu.

Chúng tôi không có kết quả nào trên cả 3 chủng đại diện E. hellem, E. cuniculi, E. intestinalis. Như vậy cặp mồi này không thích hợp cho Microsporidia thuộc chi Encephalitozoon. Chứng Âm và chứng nội cũng đều Âm tính chứng minh tính đúng của phản ứng PCR thực hiện.

Tóm lại 4 cặp mồi M1-22/ M1187-1170, Int530f/ Int580r và cặp mồi Int580f/ Int580r, Int530f/MIC23-1r hoạt động tốt trên Microsporidia chi Encephalitozoon với kích thước sản phẩm từ 1150 bp đến 1350 bp. Các cặp mồi còn lại có thể giúp chúng ta phân biệt được các loài Microsporidia thuộc chi Encephalitozoon. Kết quả hoạt động của những cặp mồi trên được tóm tắt trong bảng sau.

Các Microsporidia là những nguyên sinh động vật ký sinh nội bào bắt buộc, việc chẩn đoán và định danh chúng gặp nhiều khó khăn; hơn nữa chúng là tế bào nhân thật cũ xưa (ancient eukaryote)⁽⁸⁾ do vậy, thiếu các đặc điểm về biểu hiện kiểu hình (phenotypic). Phương pháp chính xác nhất là dùng Kính hiển vi điện tử nhưng có nhược điểm phải chuẩn bị mẫu lâu, tốn kém, thời gian quan sát phải qua nhiều giai đoạn phát triển. Các phương pháp nhuộm cải tiến đơn giản, ít tốn kém, có thể dùng trong tầm soát bệnh này nhưng độ nhạy cảm và độ đặc hiệu thấp, những phương pháp trên đều dựa trên sự quan sát khác biệt về hình thể học Microsporidia. Hiện nay có thể nói PCR 16S là chuẩn vàng "gold standard" trong việc chẩn đoán, phân biệt Microsporidia trong thế giới vi sinh vật, khảo sát cả những loài gây bệnh cũng như không gây bệnh và sẽ trở nên những xét nghiệm thường qui trong phòng thí nghiệm.

Chúng tôi, trong đề tài này tìm kiếm trước hết khả năng khuếch đại một đoạn gen mã hóa cho RNA 16S của đơn vị phân nhỏ ribosom. Trong hướng tìm kiếm đó, chúng tôi đã chiết tách được DNA từ bào tử Microsporidia trong bệnh phẩm chỉ bằng phương pháp dùng nhiệt kết hợp với hạt nhựa và siêu ly tâm. Các giai đoạn được giảm, khả năng ngoại nhiễm sẽ thấp, chất lượng các phản ứng PCR thực hiện sau này tăng cao. Chúng tôi cũng đã xác định được các thông số cần thiết của các phản ứng PCR. Chứng âm là DNA của tế bào MRC-5 đã chứng minh tính đặc hiệu của các mồi sử dụng.

Trong công trình nghiên cứu này, bằng phương pháp nhuộm Weber cải tiến và Calco-fluor từ 157 bệnh phẩm, chúng tôi tìm được 13 chủng Microsporidia (tỷ lệ 8,3 %), hơi thấp so với tỷ lệ chung từ 20-30% của Croft Simon⁽⁶⁾, hoặc 33,3 % của Wanachiwanawin (Thái Lan)⁽⁹⁾ trên các bệnh nhân có triệu chứng tiêu chảy nhưng chấp nhận được vì các tác giả khảo sát trên cả Enterocytozoon bieneusi còn chúng tôi chỉ khảo sát trên chi Encephalitozoon và phù hợp với nghiên cứu của Brandonisio⁽⁴⁾ là 9,23 %.

Với cặp mồi M1-22/M1187-1170, chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR khoảng 1200 bp kéo dài từ vị trí 1-22 cho mồi xuôi và bổ sung cho vị trí số 1203-1186 cho mồi ngược trên trình tự chủng chuẩn L19070. Ngoài ra, chúng có khuếch đại thể hiện trên tất cả chủng phân lập được (13 chủng). Vậy đây là cặp mồi để phát hiện.

Với cặp mồi Int530f/ Int580r: sản phẩm thu được là 1150 bp, theo nhiều tác giả⁽⁵⁾, kéo dài từ vị trí nucleotid 530 của gen ssu-rRNA, qua vùng ITS tới một phần của gen LSU-rRNA (khoảng vị trí 580). Phát hiện được 9 chủng, tỷ lệ nhạy là 69,2 % nhưng tỷ lệ chuyên biệt là 100% (khi so sánh trình tự chuỗi thu được với chủng chuẩn), so với công trình nghiên cứu Caspar Franzen⁽⁵⁾ cho thấy tỷ lệ nhạy là 67% (36-96%) và tỷ lệ chuyên biệt là 98% của phương pháp PCR so với 54% (25-71%) và 95% của phương pháp quan sát bằng kính hiển vi thường thì những tỷ lệ của chúng tôi là chấp nhận được. Chúng tôi cũng có kết quả như trên với cặp Int580f/ Int580r.

Với cặp mồi Int530f/ MIC23-1r, qua thí nghiệm cũng cho kết quả tốt trên các chủng đại diện E. hellem, E. cuniculi và E. intestinalis. Kích thước sản phẩm PCR vào khoảng 1350 bp nhưng cũng không dùng để phân biệt các Microsporidia thuộc chi Encephalitozoon được.

Với cặp mồi Int530f/ MIC23-2r, chúng tôi chỉ khuếch đại được trên chủng đại diện E. cuniculi, ngoài ra cặp mồi này không hoạt động được trên chủng đại diện E. hellem và E. intestinalis, kích thước sản phẩm PCR vào khoảng 1350 bp. Như vậy đây là cặp mồi để phân biệt E. cuniculi sau khi các mồi phát hiện (+). Với cặp mồi MIC23-1f/ MIC23-1r, chúng tôi chỉ có kết quả trên chủng đại diện E. hellem với kích thước sản phẩm lớn nhất, khoảng 2150 bp, theo dự kiến sẽ bắt cặp với những vùng nằm trong gen LSU-rRNA. Các chủng đại diện E. cuniculi và E. intestinalis không cho kết quả, vậy đây là cặp mồi để phân biệt. Với cặp mồi MIC23-1f/ MIC23-2r, chúng tôi không đạt kết quả như vậy trình tự mồi MIC23-2r cần phải xem xét lại hoặc không thể phối hợp với MIC23-1f.

Tóm lại, tỷ lệ nhiễm Microsporidia trên bệnh nhân AIDS có thể tới 20-30%, chúng tôi có 6 cặp mồi có thể dùng phát hiện, phân biệt các loài Microsporidia của chi Encephalitozoon nhanh chóng, cụ thể có thể dùng cặp M1-22/ M1187-1170 và ly trích DNA Microsporidia bằng nhiệt với hạt nhựa Chelex 100^R để phát hiện các Microsporidia của chi Encephalitozoon, có thể dùng cặp Int530f/ Int580r để xác định trình tự vùng ITS trong gen SSU-rRNA cũng như phần nhỏ gen lsu-rRNA. Ðể phân biệt E. hellem, có thể dùng cặp MIC23-1f/ MIC23-1r, để phân biệt E. cuniculi dùng cặp Int530f/ MIC23-2r, để phân biệt E. intestinalis dùng phương pháp loại suy với các cặp trên.

1. Trần thị Kim Dung; Lê quang Ðang; Trầøn phủ Minh Siêu, Ðinh Nguyễn huy Mẫn; Trần vinh Hiển. Tình hình nhiễm bào tử đường ruột Cryptosporidium sp. tại Trung tâm bệnh nhiệt đới TP HCM từ 1/1996 đến 7/1997. Tạp chí Y học TP HCM- số đặc biệt Hội nghị khoa học Khoa Y lần thứ 17; 1997; phụ bản số 4 (tập 1): 41-5
1. Andreas S; Didier R. A simple method for amplification of DNA from paraffinembedded tissues. Nucleic Acid Research 1992;20(19): 5237-8
2. Biderre C; Peyretaillade E; Duffieux F; Peyret P; Metenier G; Vivares C. The rDNA unit of Encephalitozoon cuniculi (Microsporidia): Complete 23S sequence and copy number. J Euk Microbiol 1997Nov-Dec; 44(6): 76S
3. Brandonisio O; Maggi P; Panaro MA; Lisi S; Andriola A; Acquafredda A; Angarano G. Intestinal protozoa in HIV-infected patients in Apulia, South Italy. Epidemiol Infect 1999 Dec;123(3):457-62
4. Caspar F; Muller A. Molecular techniques for detection, species differentiation and phylogenetic analysis of Microsporidia. Clin Microbiol Rev 1999 Apr; 243-85
5. Croft Simon L; William John; McGowan Ian. Intestinal Microsporidiosis. Seminar in Gastrointestinal 1997 Jan; Vol 8, N^o 1: 45-55
6. Fedorko DP; Hijazi YM. Application of molecular techniques to the diagnosis of microsporidial infection. Emerg Infect Dis 1996 Jul-Sep;2(3):183-91. Review
7. Vossbrinck CR; Maddox JV; Friedman S; Debrunner-Vossbrinck BA; Woese CR. Ribosomal sequence suggests microsporidia are extremely ancient eukaryotes. Nature 1987; 326: 411-4
8. Wanachiwanawin D; Manatsathit S; Lertlaituan P; Thakerngpol K; Suwanagool P. Intestinal microsporidiosis in HIV infected patients with chronic diarrhea in Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health 1998 Dec; 29(4): 767-71
9. Weber R; Bryan RT; Schwartz DA; Owen RL. Human microsporidial infections. Clin Microbiol Rev 1994 Oct; 7: 426-61