Microsporidia hiện nay được nghi ngờ về mặt sinh bệnh học chiếm tới 20-30% tiêu chảy trên người suy giảm miễn dịch do AIDS. Trước tình hình số ca nhiễm Microsporidia trên người ngày càng tăng, các phương pháp giúp định danh tới mức loài đơn giản, nhanh chóng hơn của ký sinh trùng Microsporidia được đòi hỏi. Trong đề tài này, phương pháp nhuộm Weber cải tiến và Calco-fluor trước hết được sử dụng để chẩn đoán sơ bộ, từ 157 bệnh phẩm phân của bệnh nhân AIDS tiêu chảy mãn, 13 chủng Microsporidia được tìm thấy (tỷ lệ 8,3%). Sáu cặp mồi dựa trên trình tự đơn vị phân nhỏ của ribosom (ssu-rRNA), trình tự bảo thủ của vùng nối nội (ITS), vùng mã hóa đơn vị phân lớn của ribosom (lsu-rRNA) được sử dụng để phát hiện bào tử Microsporidia thuộc chi Encephalitozoon: E. cuniculi, E. hellem, E. intestinalis. So sánh với phương pháp chuẩn hiện nay là kính hiển vi điện tử đòi hỏi tốn thời gian và máy móc hơn, phương pháp PCR dễ dàng phân biệt tới loài của các Microsporidia trong phân cũng như các bệnh phẩm lâm sàng khác chỉ trong vài giờ.

SUMMARY

PCR APPLICATION IN THE TAXONOMY OF MICROSPORIDIA OF GENUS ENCEPHALITOZOON BY GENE ITS AND LSU

Nguyen Trong Hiep, Nguyen Van Thanh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 5 - No 3 - 2001: 173 - 178

Microsporidia là 1 nhóm nguyên sinh động vật ký sinh nội bào bắt buộc. Lịch sử nhóm Microsporidia có trên 100 năm, kể từ năm 1857, Nagëli đã tìm trên loài sâu tằm (Silkworms), chúng được đặt tên là Nosema bombycis, ngoài ra chúng còn tìm thấy trên nhiều nhóm động vật như côn trùng, động vật có vú.... Cùng với đại dịch SIDA, nhiều tác nhân gây bệnh cơ hội mới đã được tìm thấy, trong đó có các Microsporidia. Càng ngày Microsporidia được xem như một tác nhân gây bệnh cơ hội đáng kể, có thể chiếm khoảng 20-30 % triệu chứng tiêu chảy không rõ nguyên nhân trên những người suy giảm miễn dịch hay AIDS. Hơn nữa, nguyên nhân du lịch ở một số vùng địa lý trên thế giới như: Caraibe, châu Phi, châu Á, Trung Ðông... cũng được xét đến^(3,5).

Việc chẩn đoán tác nhân do Microsporidia nói riêng hoặc các tác nhân bệnh nhiễm ký sinh nội bào nói chung gặp nhiều khó khăn, phức tạp với các phương pháp cổ điển. Với Microsporidia, việc chẩn đoán hiện thời chủ yếu dựa trên hình thể học qua Kính hiển vi điện tử gặp một số khó khăn về tính nhạy cảm, tính đặc hiệu đểø xác định Microsporidia đến loài và tốn thời gian. Tại Việt nam cho đến nay, chưa có nghiên cứu riêng về bệnh này, chỉ có một số khảo sát trên đơn bào gây tiêu chảy cơ hội quan trọng⁽¹⁾. Kỹ thuật PCR đã có bước tiến rất dài, PCR trên cơ sở khuếch đại đoạn gen mã hóa cho RNA của các đơn vị phân ribosom hiện nay được sử dụng trong việâc chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh và đặc biệt hữu ích với các tác nhân ký sinh nội bào bắt buộc hoặc khó nuôi cấy⁽⁷⁾.

Chúng tôi sử dụng nhiều cặp mồi (primers) khác nhau để thực hiện kỹ thuật PCR trên cơ sở khuếch đại một đoạn gen trong vùng ssu-rRNA, ITS (Internal transcribed spacer region), lsu-rRNA mã hóa cho RNA 16S và 23S của Ribosom giúp định danh và phân biệt Microsporidia chi Encephalitozoon; ngoài ra như một bước đầu để áp dụng kỹ thuật trên cho việc định danh các vi sinh vật khó nuôi cấy khác. Vì thế mục tiêu nghiên cứu gồm:

• Phân lập sơ bộ Microsporidia từ bệnh phẩm bằng các phương pháp nhuộm cải tiến
• Tiến hành PCR với các cặp mồi khác nhau, xem xét khả năng phân biệt các loài Microsporidia trong chi Encephalitozoon

Bệnh nhân đến điều trị vì hội chứng tiêu chảy kéo dài không rõ nguyên nhân, không đáp ứng với các thuốc điều trị tiêu chảy thông dụng, HIV (+), có số CD4<100 tế bào/m l trong thời gian từ 04/1999-10/1999 tại một số bệnh viện ở Paris, Pháp.

Mỗi bệnh nhân lấy phân 3 lần, lượng lấy như xét nghiệm phân thường qui, lần đầu khi nhập viện trước khi điều trị, lần 2 sau 3 ngày, lần 3 sau 1 tuần.

Trước hết phân cần xứ lý với sodium hypochlorid để tránh những chất ứng chế phản ứng PCR⁽³⁾, rồi nhuộm (10m l trải 40x20 mm) tìm bào tử theo 2 phương pháp: nhuộm Weber cải tiến, quan sát bằng kính hiển vi quang học, vật kính x 100 và nhuộm bằng Calco-fluor. Với phương pháp Weber cải tiến, bào tử ăn màu tím đen, kích thước khoảng 1-1,5x 2-2,5 m m tùy theo loài. Với phương pháp Calco-fluor, quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (bước sóng 350-380nm) x 100, trên nền màu đen tìm các bào tử phát huỳnh quang màu vàng xanh, kích thước như trên, kết hợp cả 2 phương pháp nhuộm sẽ hạn chế các ca Dương giả. Các bào tử Microsporidia gây bệnh thuộc các chi khác thường nhỏ hơn. Kiểm tra khoảng 100 thị trường khác nhau, cần có ít nhất 1 bào tử/thị trường để đảm bảo có 10⁴-10⁶ bào tử/g phân, điều chỉnh bằng ly tâm.

Chúng tôi sử dụng phương pháp nhiệt kết hợp với hạt nhựa Chelex ^R 100 vì đơn giản, giảm bước thực hiện do đó giảm nguy cơ ngoại nhiễm cho mẫu, tránh đưa nhiều hóa chất vào mẫu có thể gây ra những phản ứng không biết trước ức chế PCR, tính kiềm của dung dịch nhựa ở nhiệt độ cao phá vỡ được màng bào tử⁽²⁾û.

Chúng tôi chọn những cặp mồi trước hết nhắm vào đích là trình tự chuỗi mã hóa cho RNA 16S trong đơn vị phân nhỏ ribosom (ssu-rRNA), dựa trên các trình tự của gen này đã được công bố chính thức. Tiếp theo sẽ là những cặp mồi không những sẽ khuếch đại đoạn gen trên mà còn kéo dài qua đoạn ITS (internal transcribed spacer) tới đoạn gen mã hóa cho RNA 23S ribosom của đơn vị phân lớn (lsu-rRNA).

• Mồi xuôi M1-22 và mồi ngược M1187-70 có trình tự bổ sung từ vị trí số 1-22 cho mồi xuôi và bổ sung từ vị trí 1129-1112 cho mồi ngược so với trình tự của V. necatrix, GENBANK Acession N^o Y00266, cũng cùng vị trí số 1-22 và bổ sung cho vị trí số 1203-1186 của chủng E. hellem GENBANK Acession N^o L19070 (đều trong vùng ssu-rRNA), đây là 2 chủng mà trình tự gen thường được sử dụng để tạo nên các cặp mồi cho việc phát hiện, phân biệt các Microsporidia⁽³⁾.
• Chúng tôi sử dụng cặp mồi Int530f/ Int 580r mà theo nhiều tác giả có thể áp dụng chung cho các Microsporidia trong chi Encephalitozoon, khuếch đại một vùng trong gen ssu-rRNA khoảng vị trí nucleotid 530 đến một phần nhỏ trong đoạn gen lsu-rRNA (vị trí 580). Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm tạo các cặp mồi trên cơ sở dữ liệu là trình tự chuỗi của 2 chủng trên để có được các mồi Int580f, MIC23-1f, MIC23-1r, MIC23-2r và áp dụng chạy PCR trên các chủng phân lập được cũng như các chủng đại diện: E. hellem (L19070), E. cuniculi (U09929) và E. intestinalis (L17072) (là 3 loài gây bệnh của chi Encephalitozoon) để thử khả năng phân biệt Microsporidia thuộc chi Encephalitozoon. Chúng tôi dùng 7 cặp mồi phối hợp: M1-22/M1187-1170; Int530f/Int580r; Int580f/Int580r; Int530f/MIC23-1r; Int530f/MIC23-2r; MIC23-1f/MIC23-1r; MIC23- 1f/MIC23-2r.

Thành phần phản ứng PCR gồm: Tampon Taq 10X 10 m l, Taq DNA polymerase(5UI/m l) 0,6m l (Perkin elmer cetus), MgCl₂ 5 mmol/l 6m l, dNTPs (10 pmoles/ml) 2m l, mồi xuôi và ngược (10 pmoles/m l) 3,9m l (Boehringer Mannheim Biochemicals), DMSO 5m l (Sigma chemical-Aldrich Co.Ltd), , DNA bào tử 1m l, nước cất 58,6m l. Tổng cộng 100m l.

Chương trình gồm các bước sau:

- Bước 1: 95^o C trong 2 phút (1 chu kỳ)

- Bước 2: giai đoạn 1: 95^oC trong 30 giây; giai đoạn 2: 52^oC trong 30 giây; giai đoạn 3: 72^oC trong 1 phút.

- Bước 3 được lặp đi đặp lại 35 lần tạo ra 35 chu kỳ.

- Bước 4: 72^o C trong 10 phút (chu kỳ)

- Kết thúc 4^oC.

Chương trình này được thực hiện trên máy luân nhiệt PTC-200 (Thermocycler, MJ Research, San Francisco, CA). Sản phẩm PCR được tinh khiết hóa nhờ " QIAquick spin PCR purification Kit" (QIAGEN GmbH, Germany) đúng theo qui trình cung cấp bởi nhà sản xuất. Phát hiện sản phẩm PCR trên gel thạch 1% pha trong đệm TBE 0,5X, nhuộm với Ethidium Bromide. Cho vào mỗi giếng chạy 8 m l sản phẩm+ đệm tải (loading buffer) màu. Hai giếng bờ được chạy với 5 m l Marker VI (Boehringer Mannheim Biochemicals) với các dải DNA lần lượt là 2176, 1766, 1230, 1033 và 653 cặp base-base pair (bp)... Chứng (+) là chủng L19070, chứng (-) là nước cất, chứng nội là DNA tế bào MRC-5 (human embryonic lung fibroblast) chiết cùng phương pháp.