Xác định carcinom vi xâm nhập và thâm nhiễm giả
Carcinom vi xâm nhập thường được xác định bằng sự thấm nhập qua khỏi màng đáy. Kháng thể chống màng đáy được dùng là collagen typ IV hoặc laminin(2). Màng đáy có thể Ûbị gián đoạn một ít trong mô lành tính, còn trong carcinom vi xâm nhập màng đáy bị mất hay bị phá hủy.
Các tổn thương lành tính thâm nhiễm giả rất khó phân biệt với carcinom xâm nhập, đặc biệt là ở vú và tuyến tiền liệt. Màng đáy còn nguyên vẹn, rõ ràng bao quanh đám tế bào nghi ngờ gợi ý tổn thương lành tính hoặc carcinom tại chỗ.
Trong mô vú màng đáy bao gồm cả tế bào cơ biểu mô, được xác định bằng kháng thể chống actin. Sự hiện diện của tế bào cơ biểu mô quanh các ống tuyến "xâm nhập" gợi ý tổn thương lành tính. Tuy nhiên nếu không có tế bào cơ biểu mô cũng không đủ để chẩn đoán ác tính vì tế bào cơ biểu mô phân bố không đều, có thể không bắt gặp trên lát cắt.
Trong mô tuyến tiền liệt có thể phân biệt tế bào đáy với tế bào lòng ống bằng sự biểu hiện khác nhau của các sợi trung gian cytokeratin. Các tế bào đáy biểu hiện cytokeratin có trọng lượng phân tử cao, còn các tế bào lòng ống biểu hiện cytokeratin có trọng lượng phân tử thấp. Hình ảnh phản ứng miễn dịch này có thể dùng để phân biệt tổn thương lành và ác ở tuyến tiền liệt bởi vì tế bào đáy hiện diện ở hầu hết các tăng sản lành tính nhưng không bao giờ hiện diện quanh các tuyến ác tính.
Xác định carcinom di căn thầm lặng
Di căn hạch vùng là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất đối với hầu hết các loại u. Xét nghiệm giải phẫu bệnh thường quy có thể xác định được ung thư di căn đến hạch nhưng theo Gusterson và Ott(9) thì một bác sĩ giải phẫu bệnh chỉ có 1% cơ hội phát hiện ra các ổ ung thư di căn nhỏ chỉ gồm 3 tế bào. Các nghiên cứu khác cho thấy có từ 8 -30% ung thư vú di căn đến hạch không được phát hiện trên xét nghiệm giải phẫu bệnh thường quy(3,7,8,12,13,16).
Hóa mô miễn dịch có thể xác định vi di căn thầm lặng (occult) đến tủy xương khoảng 25 - 30% bệnh nhân carcinom vú giai đoạn đầu (giai đoạn còn khả năng phẫu thuật).
Các kháng nguyên "u"
Gồm 4 loại:
Các kháng nguyên đặc hiệu của u
Gồm các gen sinh ung bị đột biến và các sản phẩm gen ức chế khối u, như protein p53.
Thay đổi vị trí phân bố kháng nguyên trên tế bào
Vị trí phân bố kháng nguyên trên tế bào bình thường khác với tế bào ác tính. Kháng nguyên CEA, B72.3, EMA chỉ có ở mặt lót lòng ống tuyến bình thường, nhưng ở các tế bào tuyến ung thư thì hiện diện trên toàn bộ màng tế bào và trong bào tương. Ðó là do gia tăng tích tụ kháng nguyên, giảm sự vận chuyển và màng tế bào bị vùi vào bào tương.
Thay đổi mức độ (tăng hoặc giảm) biểu hiện kháng nguyên trên tế bào
Một số kháng nguyên gia tăng biểu hiện ở các tế bào ác tính và một số khác lại giảm biểu hiện. Các kháng nguyên này kết hợp với chức năng biệt hóa của tế bào như kháng nguyên GCDFP-15 (vú), thyroglobulin và calcitonin. Mặc dù nhiều khối u vẫn tiếp tục sản xuất ra các sản phẩm như tế bào bình thường, và mất dần khi u càng kém biệt hóa. Thí dụ carcinom vú biệt hóa cao thường biểu hiện GCDFP-15, nhưng carcinom vú biệt hóa kém thường không biểu hiện(17). Tương tự thyroglobulin của tuyến giáp cũng vậy. Trong thực tế, giảm biểu hiện thyroglobulin của carcinom tuyến giáp có tiên lượng xấu(16). Một thí dụ khác là các tế bào vỏ thượng thận biểu hiện cytokeratin nhưng không biểu hiện vimentin, trong khi carcinom tuyến vỏ thượng thận biểu hiện vimentin nhưng không biểu hiện cytokeratin còn u lành tuyến thượng thận biểu hiện cả hai kháng nguyên(6).
Những biến đổi sinh hóa của kháng nguyên
Các kháng nguyên liên quan nhóm máu (ABH) là những carbohydrate biểu hiện trên các tế bào biểu mô, các tế bào nội mô và hồng cầu. Kháng nguyên ABH không biểu hiện ở tế bào biểu mô tuyến đại tràng bình thường mà biểu hiện ở tế bào carcimom tuyến đại tràng(4). Ngược lại, niệu mạc bình thường biểu hiện kháng nguyên ABH, nhưng carcinom niệu mạc thì không biểu hiện. Còn các kháng nguyên nhóm máu loại Lewis (Lex và Ley) không thấy ở niệu mạc bình thường nhưng gặp trong hầu hết các u niệu mạc(5). Sự thay đổi này giúp chẩn đoán và tầm soát carcinom niệu mạc. Xác định Lex trong các tế bào niệu mạc tróc giúp phát hiện u niệu mạc và có thể dùng như chất đánh dấu sớm của ung thư bàng quang tái phát.
Xác định yếu tố tiên lượng trong ung thư
Các kháng nguyên liên quan đến sự tăng sinh tế bào gồm: Ki67 và proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
Ki67 là kháng nguyên ở nhân tế bào, hiện diện -ở kỳ hoạt động của tế bào (G1, S, G2 và phân bào), không có ở kỳ nghỉ ngơi (G0). PCNA cũng phân bố trong chu kỳ hoạt động của tế bào như Ki67 nhưng khác ở mức độ biểu hiện.
Ki67 và PCNA liên quan mật thiết với hình thái tăng trưởng tế bào, đặc biệt là chỉ số phân bào và độ mô học của u. Trong ung thư vú sự biểu hiện cửa Ki67 và PCNA liên quan đến các marker khác của sự biệt hóa và tiên lượng như estrogen-progesteron, p53.
Những bệnh nhân có thời gian sống thêm ngắn thường có tỷ lệ Ki67 và PCNA cao.
Chẩn đoán phân biệt u lành và ung thư
Phương pháp hóa mô miễn dịch có lợi thế trong việc xác định nguồn gốc tế bào nhưng bị hạn chế trong việc xác định u lành hay u ác tính, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt như:
(1) trong chẩn đoán phân biệt phản ứng lành tính của mô lymphô và lymphôm nhờ dựa vào nhuộm đồng thởi cả 2 kháng thể chống chuỗi nhẹ kappa và lambda. Nếu cả hai đều dương tính là phản ứng lành tính, còn chỉ một trong hai dương tính hay cả hai đều âm tính là lymphom.
(2) Kháng nguyên CEA không hiện diện hoặc hiện diện rất ít ở mặt trên của tế bào tuyến niêm mạc dạ dày, nhưng hiện diện rất nhiều trong bào tương cũng như trên màng tế bào tuyến ác tính, do đó có thể áp dụng để chẩn đoán carcinom tuyến giai đoạn sớm chỉ ở lớp niêm mạc và các trường hợp không rõ ràng khác. Tuy nhiên cần phải cân nhắc cẩn thận và loại trừ cả yếu tố âm tính giả và dương tính giả trước khi kết luận.
Dự đoán đáp ứng điều trị
Xác định thụ thể Estrogen, Progesteron
Sự biểu hiện của cả hai thụ thể progesteron và estrogen trên carcinom vú có liên quan mật thiết đến tiên lượng của bệnh nhân và cũng liên quan đến các yếu tố tiên lượng khác như độ mô học và giai đoạn bệnh. Các u biệt hóa cao và ở giai đoạn thấp thường có thụ thể estrogen và progesteron dương tính.
Các thử nghiệm chống thụ thể cho phép dự đoán đáp ứng điều trị ung thư vú bằng hormon. Các u không biểu hiện thụ thể estrogen hay progesteron có khả năng đáp ứng thấp với hormon liệu pháp và ngược lại.
Các thụ thể estrogen và progesteron nằm ở nhân tế bào, còn phản ứng dương tính ở bào tương là không đặc hiệu.
Tiền gen sinh ung Her-2/neu
Tiền gen sinh ung Her-2/neu hay c-erbB-2 được phân lập đầu tiên từ u nguyên bào hạch thần kinh của chuột. Protein mã hóa gen này (185 KD) cho thấy có sự tương đồng với thụ thể của yếu tố phát triển thượng bì (epidermal growth factor receptor: EGFR).
Sự khuếch đại mã hóa gen Her-2/neu được mô tả ở vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, tuyến nước bọt, phổi đại tràng và carcinôm tế bào gai. Khoảng 25 - 30% bệnh nhân ung thư vú và 1/3 bệnh nhân ung thư buồng trứng có biểu hiện khuếch đại gen này. Các bệnh nhân này thường có tỷ lệ tái phát cao và thời gian sống thêm ngắn hơn các ung thư không có gen Her-2/neu.
Mặc dù sự gia tăng biểu hiện và khuếch đại mã hóa gen Her-2/neu có ở nhiều tạng nhưng gen này thường được nghiên cứu ở ung thư vú. 25 - 30% ung thư vú nguyên phát có gia tăng biểu hiện gen Her-2/neu trên những tế bào ung thư, không có trên tế bào biểu mô tuyến vú bình thường. Sự gia tăng biểu hiện gen Her-2/neu tỷ lệ nghịch với biểu hiện thụ thể estrogen (ER) và progesteron (PR), các bệnh dương tính với ER và PR có tỷ lệ Her-2/neu dương tính thấp hơn các bệnh nhân ER và PR âm tính. Sự hiện diện của gen Her-2/neu cũng liên quan đến độ mô học của u., tỷ lệ Her-2/neu dương tính cao ở những u có độ mô học cao. Sự gia tăng biểu hiện gen Her-2/neu còn cho thấy bệnh nhân sẽ không đáp ứng với hóa trị quy ước nhưng thuận lợi hơn đối với các phác đồ cải tiến(11).
Xác định tế bào nhiễm khuẩn
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch có thể phát hiện được sớm, nhanh chóng và chính xác các vi sinh vật khó phát triển trong môi trường cấy như Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Pneumocystic carinii... So với các phương pháp khác như dùng kỹ thuật lai tại chỗ thì kỹ thuật hóa mô miễn dịch nhanh và đặc hiệu hơn. Có khoảng hơn 60 loại vi khuẩn và virus có thể phát hiện bằng hóa mô miễn dịch trên khối mô vùi nến:
- Cytomegalovius
- Human papilloma virus
- Virus viêm gan siêu vi A, B, C
- Epstein-Barr virus
- Toxoplasma gondii
- Entamoeba histolytica
- Herpes simplex virus
- ... v.v...
KỸ THUẬT NHUỘM
Quy trình nhuộm thời gian
- Mẩu mô sau khi cắt mỏng được sấy khô ở 370C 12 giờ
- Khử nến trong xylen, cồn và nước cất 10 phút
- Dung dịch đệm PBS (pH= 7,2) 5 phút
- Ức chế peroxydase nội sinh bằng hydrogen peroxide 3% 6 phút
- PBS 5 phút
- Protein Blocking Agent ( 3 giọt) 15-20 phút
- Ủ trong kháng thể thứ I (chuột hoặc thỏ) 100ml 45 phút
- PBS 5 phút
- Ủ trong kháng thể thứ II có gắn Biotin (3 giọt) 30 phút
- PBS 5 phút
- Ủ với phức hợp Streptavidine peroxydase (3 giọt) 20 phút
- PBS 5 phút
- Ủ trong Chromogène EAC (hoặc DAB*) 500ml 10-15 phút
- Rửa nước cất 5 phút
- Nhuộm nhân với Hematoxylin tạo nền tương phản 1 phút
- Rửa nước cất 5 phút
- (*) Nếu dùng DAB thì khử nước tiếp tục bằng cồn và làm trong sáng mô bằng xylen
- Dán lamen bằng Geltol (nếu dùng EAC) hoặc Resin (nếu dùng DAB)
Kết quả nhuộm
Âm tính: chỉ có màu xanh tím của Hematoxylin nhuộm nhân.
Dương tính: nếu có hiện diện kháng nguyên trên tế bào, phức hợp kháng nguyên-kháng thể-streptavidine-màu sẽ cho màu đỏ (nếu dùng EAC) hoặc vàng nâu (nếu dùng DAB).
CÁC GIỚI HẠN CỦA PHƯƠNG PHÁP
Phản ứng dương tính giả
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch có thể cho phản ứng dương tính giả do:
Ø mô nền bị nhuộm đậm.
Ø Lượng kháng thể quá nhiều
Ø Thời gian ủ kháng thể quá lâu
Ø Nhiều chất màu
Ø Khử không hết peroxidase nội sinh
Phản ứng âm tính giả
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch có thể cho phản ứng âm tính giả do:
Ø Các vị trí tiếp xúc trên kháng nguyên không được bộc lộ tốt.
Ø Kháng nguyên bị phá hủy do quá trình cố định
Ø Kháng thể bị hỏng do bảo quản không kỹ
Ø Lượng kháng thể quá ít
Ø Thời gian ủ quá ngắn không đủ cho phản ứng xảy ra.
Ø Mẩu mô không dính sát vào phiến kính.
Ø pH của dung dịch đệm không đúng
Ø Nhiệt độ quá nóng
Ø Ðể khắc phục những nhược điểm trên:
Ø cần có tiêu bản chứng âm hoặc chứng dương
Ø tuân thủ nghiêm nhặt quy trình nhuộm về nồng độ kháng thể, thời gian, pH của dung dịch đệm....
Các nhược điểm khác
- Không phân biệt được u lành và u ác
- Ðắt tiền
KẾT LUẬN
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch là một kỹ thuật hiện đại giúp xác định nguồn gốc mô, chẩn đoán chính xác u, giúp điều trị tốt các loại ung thư, giúp tiên lượng và theo dõi điều trị. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là đắt tiền và không phân biệt được u lành hay u ác trừ một số trường hợp đặc biệt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. AZURI N, CZERNOBILSKY B: Immunohistochemistry. In: Blaustein's pathology of the female genital tract. 4th ed, Springer-Verlag, 1994
2. BIREMBAUT P, CARON Y , ADNET JJ, FROIDART JM:Usefulness of basement menbrane markers in tumoural pathology, J Pathol 145:283, 1985.
3. BUSSOLATI G, GUGLIOTTA P, MORRA I et al: micrometastases detection of lymph-nodes metatases from infiltrating lobular carcinoma of the breast, Br j Cancer 54:631,1986.
4. CORDON-CARDO C, LLOYD KO, SAKAMOTO J et al.: Immunohistologic expression of blood-group antigensin normal human gastrointestinal tractand colonic carcinoma, Int J Cancer 37: 667, 1986.
5. CORDON-CARDO C, VICTOR RO, LLOYD KO, et al.: Blood group -related antigens in human urothelium: enhanced expression precursor, Lex, and Ley determinants in urothelial carcinoma , Cancer Res. 48: 4113, 1988.
6. COTE RJ, TAYLOR CR: Immunohistochemistry and related marking techniques. In: Damjanov I, Linder J: Anderson's Pathology, 10th ed., Mosby, 1996.
7. DEARNALY DP, ORMEROD MG, SLOANE JP: Micrometastases in breast cancer: long-term follow-up of the fist patient cohort, Eur J Cancer 27::236, 1991.
8. FISHER ER, SAMINOSS S, LEE CH et al: detection and significance of occult axillary micrometastases in breast cancer, Cancer 42::2025, 1978.
9. GUSTERSON BA, Ott R: Occult axillary lymph-nodes micrometastases in breast cancer,Lancet (336):434, 1990.
10. MASON DY, GATTER KC: The role of immunocytochemistry in diagnostic pathology. J Clin Pathol, 1987: 40: 1042-1054.
11. MUSS HB, THOR AD, BERRY DA et al.: c-erb-2 expression and response to adjuvant therapy in women with node positive early breast cancer. N Engl J Med 1994: 330: 1260.
12. NEVILLE AM: Breast cancer micrometastases in lymph-nodes and bone marrow are prognotically important, Ann Oncol 2:13, 1991.
13. TROJANI M, MASCAREL I, BONICHON F et al: micrometastases to axillary lymph-nodes from carcinoma of breast: detection by immunohistochemistry and prognostic significance, Br J Cancer 55:303, 1987.
14. TRUE LD: Principles of immunohistochemistry. In: True LD (ed.): Atlas of diagnostic immunohistopathology, J. B. Lippincott Company, New York 1990.
15. VENKATESH YS, ORDÓNẼZ NG, SCHULTZ PN et al: anaplastic carcioma of the thyroid: a clinicopathologic study of 121 cases, Cancer 66:321, 1990.
16. WELL CA, HERYET A, BROCHIER J et al: The immonocytochemical detection of axillary micrometastases in breast cancer, Br J Cancer 50:193, 1984.
17. WICK MR, Lillemoe TJ, Copland GT et al: Gross cystic disease fluid protein - 15 as a marker for breast cancer: immunohistochemical analysis of 690 human neoplasms and comparison with alpha-lactabumin. Hum Path 1989, 20: 281.
