SUMMARY

Immunofluorescence in the diagnosis of glomerular diseases: a preliminary report

Mai Le Hoa * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Special issue of internal medicine - Vol. 5 - Supplement of No 2 - 2001: 34 - 40

Sinh thiết thận đã từ lâu trở thành một phương tiện chẩn đoán quan trọng trong thận học, đặc biệt là đối với các bệnh lý cầu thận. Ðể có được chẩn đoán mô học chính xác và đầy đủ, mẫu mô thận thường cần được xử lý và khảo sát bằng cả 3 kỹ thuật: 1) nhuộm hoá mô và khảo sát dưới kính hiển vi quang học, 2) cắt lạnh, nhuộm miễn dịch huỳnh quang và khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, 3) cắt siêu mỏng, nhuộm citrate chì và uranyl acetate để khảo sát dưới kính hiển vi điện tử¹.

Tại thành phố Hồ Chí Minh, sinh thiết thận đã được thực hiện tại nhiều nơi^(2,3). Tuy nhiên cho đến nay, chẩn đoán mô học sinh thiết thận chủ yếu chỉ dựa vào nhuộm hoá mô và khảo sát dưới kính hiển vi quang học, do vậy đối với nhiều bệnh lý cầu thận, việc chẩn đoán chính xác sẽ khó thực hiện được. Ngày nay, chúng ta đã biết rằng một trong những cơ chế bệnh sinh quan trọng của các bệnh lý cầu thận là sự lắng đọng các phức hợp miễn dịch tại thận, trong đó có các globulin miễn dịch và các thành phần bổ thể, từ đó kích hoạt quá trình viêm và dần dần phá hủy nephron⁽⁴⁾. Ðể phát hiện được sự lắng đọng này thì không thể chỉ dựa vào nhuộm hoá mô mà cần phải sử dụng kỹ thuật hoá miễn dịch, thông dụng nhất là miễn dịch huỳnh quang. Ðối với một số bệnh cầu thận, miễn dịch huỳnh quang có vai trò quyết định chẩn đoán, còn đối với rất nhiều bệnh cầu thận khác thì miễn dịch huỳnh quang có vai trò củng cố chẩn đoán hoặc giúp phân loại bệnh⁽⁵⁾. Do đó, để có thể chẩn đoán chính xác các bệnh lý cầu thận, nhất thiết phải có sự kết hợp giữa kỹ thuật hóa mô và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, đặc biệt trong điều kiện chưa có kính hiển vi điện tử.

Vì vậy, mục tiêu của đề tài chúng tôi là nhằm mô tả và bước đầu ứng dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trong chẩn đoán các bệnh lý cầu thận, qua đó phát hiện chẩn đoán được một số bệnh lý cầu thận mà trước đây chưa thể chẩn đoán chính xác khi chưa ứng dụng kỹ thuật này.

Từ tháng 5 đến tháng 12/2000, tại Khoa Phổi-Thận, Bệnh Viện Chợ Rẫy, chúng tôi đã tiến hành sinh thiết thận 40 trường hợp, trong đó có 30 trường hợp được thực hiện kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Bệnh nhân khảo sát siêu âm trước, sau đó được sinh thiết mù với kim Silverman cải tiến 14G⁶ khi đã loại trừ các chống chỉ định⁽²⁾. Mẫu mô thận sinh thiết được sẽ được cắt ngang làm 2 phần, phần dài hơn được xử lý và nhuộm theo 4 phương pháp là hematoxylin-eosin (HE), periodic acid-Shiff (PAS), Masson trichrome, và Jones silver methenamine (PASM) để khảo sát dưới kính hiển vi quang học (tại Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh, Trường ÐHYD TPHCM), phần nhỏ còn lại có chiều dài khoảng 3 - 4 mm được dành cho khảo sát miễn dịch huỳnh quang⁽¹⁾ (tại Phòng Thí Nghiệm Trường ÐHYD - TPHCM).

Mẫu mô thận dành cho miễn dịch huỳnh quang được đặt vào khuôn nhựa nhỏ, cho hợp chất OCT (Tissue-Tek) vào đầy khuôn và làm đông lạnh tức thì ("snap-frozen") trong nước đá CO₂ đang tan trong aceton. Cắt lạnh được thực hiện ở nhiệt độ -24⁰C đến -22⁰C với độ dày của lát cắt là 4m m, và ít nhất 24 lát cắt cho mỗi trường hợp. Lame được để khô tự nhiên trong 30-60 phút trước khi nhuộm, nếu chưa nhuộm được ngay thì lame sẽ được giữ ở 4⁰C không quá 3 ngày.

Chúng tôi sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp với 7 loại kháng thể đặc hiệu đa clone có gắn FITC (fluorescein isothiocyanate) kháng globulin miễn dịch, thành phần bổ thể, và fibrinogen của người bao gồm: anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-C3, anti-C4, anti-C1q, và anti-fibrinogen (Dako A/S, Denmark). Các kháng thể được pha loãng dần để xác định độ pha loãng thích hợp sao cho giảm thiểu phản ứng không đặc hiệu trong khi vẫn duy trì được độ dương tính mạnh⁽⁷⁾. Mỗi loại kháng thể sẽ được ủ với 3 - 4 lát cắt. Ngoài ra, trong trường hợp nghi ngờ hội chứng Alport, chúng tôi còn nhuộm miễn dịch huỳnh quang kép với kháng thể đặc hiệu đơn clone kháng chuỗi a 2 (gắn Texas - Red) và kháng chuỗi a 5 (gắn FITC) của collagen loại IV⁸ (Shigei Medical Research Institute, Okayama, Japan). Ủ kháng thể được thực hiện trong hộp giữ ẩm, ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong khoảng 60 phút, sau đó, ngâm rửa lame trong dung dịch đệm phosphate buffer saline (PBS) pH= 7,30 ba lần, mỗi lần 3 phút, nhỏ glycerine lên lame, đậy lamelle, quan sát ngay dưới kính hiển vi huỳnh quang và chụp ảnh lưu lại.

Tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang được cho là đủ để đánh giá khi có ít nhất 4 cầu thận⁽¹⁾. Tiêu bản sẽ được quan sát để đánh giá sự lắng đọng của các globulin miễn dịch, các thành phần bổ thể, và fibrinogen ở cầu thận, màng đáy ống thận, và thành mạch máu. Ðối với cầu thận, vị trí lắng đọng sẽ được nêu rõ là ở khoảng gian mô (mesangium) hoặc ở màng đáy mao mạch cầu thận (capillary), với kiểu lắng đọng là dạng hạt (granular) hoặc dạng đường liên tục (linear). Mứùc độ dương tính sẽ được đánh giá theo 4 mức độ: dương tính 3+ (mạnh), 2+ (trung bình), và 1+ (yếu), và âm tính⁽⁵⁾.