PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR),

MỘT CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ

Phạm Hùng Vân*

TÓM TẮT :

            Thử nghiệm PCR đã thật sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử với các áp dụng kỳ diệu trong mọi lãnh vực. Ngày nay PCR có thể được triển khai áp dụng tại bất cứ một phòng thí nghiệm nào thử nghiệm được thực hiện tương đối đơn giản, giá thành của thử nghiệm không còn quá cao đến nỗi không thể chấp nhận được như trước đây.

PCR, THE GREAT REVOLUTION IN MOLECULAR BIOLOGY

Phạm Hùng Vân, Y học TP. Hồ Chí Minh. 1996, N⁰. Special : 27 - 35

SUMMARY

            With the fantastic applications in all scientific fields, PCR has really done a great revolution in molecular biology. Today PCR can be set up at any laboratory because the PCR technique is very simple, and the price cost of one test in not unacceptable as before.

            Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở tiểu bang California , trên đường lái xe dọc theo bờ biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một nhà sinh hóa học rất tầm thường, làm việc cũng tại một phòng thí nghiệm hết sức tầm thường. Ý tưởng này khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel y học.

THỬ NGHIỆM PCR LÀ GÌ ?

            Nguyên tắc của thử nghiệm PCR

            PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid đích thành hàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước (hình 1), mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau : (1)  Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên khoảng 94⁰C để làm biến tính nucleic acid đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biến tính (denaturation) DNA đích (11) . Kế đó là giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống khoảng 55⁰C để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu thì những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu (111) Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng lên khoảng 72⁰C là nhiệt độ tối hảo để men polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn là các sợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp). Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside tri phosphate (dNTP), và chiều của sự tổng hợp là 5’ ® 3’ (đoạn mồi) hay 3’® 5’ (ssDNA đích)^[1,3].

            Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử nghiệm PCR, thường nên có thêm một giai đoạn gọi là bù thêm (soaking). Giai đoạn này nhiệt độ được giữ 72⁰C trong thời gian tương đối lâu, từ 10 phút đên 1 giờ. Ðây là giai đoạn để một số các bản sao của DNA đích vì một lý do nào đó trong các giai đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo dài được một các đồng bộ như các bản sao khác, có thể kéo dài hoàn tất nốt chiều dài của nó. Trong những chu kỳ nhiệt đầu, sản phẩm PCR thường có kích thước không đều nhau vì chuỗi bổ sung được tổng hợp trên khuôn mẫu của chuỗi đích có trong bệnh phẩm. Càng về sau thì khuôn mẫu để tổng hợp chuỗi bổ sung chính là các sản phẩm PCR, nên kích thước của các sản phẩm PCR rất đều nhau (hình 1).

Hình 1 : Nguyên tắc của thử nghiệm PCR.

            Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N.2ⁿ bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon, lớn như vậy (trên 10⁹ bản sao sau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di phát hiện kích thước của sản phẩm bằng probe tóm bắt, Southern blot rồi phát hiện sản phẩm).

            Các thành phần tham gia thử nghiệm PCR

            Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau đây :

• DNA hay nuceic acid đích, tức là chuỗi acid nucleic (ví dụ đoạn acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền,. ) mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích. Một trường hợp khác là trong bệnh phẩm có nucleic acid đích, nhưng do bệnh phẩm được sửa soạn không thích hợp hoặc không đúng cách nên  nucleic acid đích không bộc lộ ra ; hoặc trong bệnh phẩm hãy còn các chất ức chế phản ứng PCR. Trong những trường hợp này kết quả PCR sẽ âm tính, nhưng là âm tính giả. Vì vậy vấn đề sửa soạn bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh.
• Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đan. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. (11) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’, (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi là down-stream prime. Cặp mồi này quyết định nên kích thước củasản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu.
• dNTP, deoxy nucleoside triphosphate, tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích. Năng lương để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lương của triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứng không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate).
• Men polymerase,  phải là men polymerase chịu được nhiệt độ. Ngày nay có nhiều loại polymerase chịu được nhiệt độ đã được ly trích hoặc tổng hợp, tùy mục đích sử dụng mà chúng ta có thể chọn polymerase thích hợp. Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase. Là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus,  là các vi khuẩn sống được trong các suối nước nóng.
• Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl­₂ 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể  thêm tween hay formamide nữa. Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl₂, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl₂ thích hợp nhất.

Ngoài ra, một thiết bị hết sức quan trọng cho thử nghiệm PCR là máy chu kỳ nhiệt (thermal cycler) là máy có thể đưa nhiệt độ trong buồng ủ PCR lên cao rồi hạ xuống trong những khoảng thời gian nhất định theo chương trình mà người sử dụng định sẵn.

HAI BƯỚC TIẾN QUAN TRỌNG ÐÃ ÐƯA THỬ NGHIỆM PCR ÐẾN CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG SINH HỌC PHÂN TỬ

Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ

Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tei61n đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn. Thử tưởng tượng nếu không men polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả bao nhiêu một khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì men cũ đã bị hủy bởi nhiệt độ trong chu kỳ nhiệt trước đó ? Cũng nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn. Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra [1]. Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu),. Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các ci khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo),. Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu,. Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa để sử dụng cho đúng mục đích của mình.

Máy chu kỳ nhiệt

Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên túc chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy các thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng. Dau đó công việc bằng tay nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền. Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực hiện trong các buồng ủ PCR của máy chu kỳ nhiệt, còn gọi là máy luân nhiệt. Một cách tổng quát, máy luân nhiệt gồm các bộ phận chính như sau :

·     Một bàn phím đơn giản để lập các chương trình chu kỳ nhiệt và ra các mệnh lệnh để máy thực hiện.

·     Một bộ vi xử lý để ghi nhớ các chương trình đã nạp vào máy, thực hiện các mệnh lệnh đền buồng ủ PCR, cũng như ghi nhận cách thay đổi nhiệt độ buồng ủ PCR trong các chu kỳ nhiệt để điều chỉnh cho đúng với chương trình đang được thực hiện.

·     Buồng ủ PCR là nơi mà các chu kỳ nhiệt được thực hiện qua dự điều khiển của bộ vi xử lý. Trong các chu kỳ nhiệt, nhiệt độ trong buồng ủ PCR có thể đưa lên cao hay hạ xuống thấp trong một thời gian rất ngắn. Ðể làm thay đổi được nhiệt độ trong buồng ủ PCR, có hai phương pháp : (1) Liên tục thổi lên buồng ủ những luồng khí nóng sinh ra từ một đèn phát nhiệt, hay luồng khí lạnh sinh ra từ một dàn lạnh của máy làm lạch. Với phương pháp này, máy luân nhiệt hãy còn tương đối cồng kềnh, khá đắt tiền và khi máy hoạt động âm thanh cũng khá ồn ào. (11) Phương pháp thứ hai hoạt động dựa theo hiệu quả Peltier ngược. Hiệu quả Peltier là nguyên tắc của các máy đo nhiệt độ điện tử : Khi áp hai mãnh kim loại vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phản ánh sự cách biệt  nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại. Hiệu quả Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh : bên này nóng, bên kia lạnh. Khi thay đổi chiều dòng điện thì nhiệt độ của hai mãnh cũng thay đổi ngược lại : bên này lạnh, bên kia nóng. Các máy chu kỳ nhiệt hiện nay đều được chế tạo dựa theo phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trứơc đây. Ví dụ hiện nay chúng ta có thể trang bị cho phòng thí nghiệm máy chu kỳ nhiệt  nhỏ có 16 giếng phản ứng, với giá chỉ khoảng 1800 USD (minicycler của hãng MJ research) so với hàng chục ngàn USD như trước đây.

PCR ÐÃ LÀM NÊN MỘT CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ

            PCR và các áp dụng của nó hiện nay trong nhiều lãnh vực đã và đang làm được những kết quả thật sự kỳ diệu, đã làm cho các công trìng nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn gấp nhiều lần so với trước kia. Nếu trước đây một thử nghiệm sinh học phân tữ phải kéo dài hàng tuần, thậm chí hàng tháng, thì nay cũng thí nghiệm có cùng mục đích như vậy, với PCR chỉ thực hiện trong vài ngày. Nếu trước đây có những mục đích thí nghiệm không thể thực hiện được, thì ngày nay với PCR mục đích này lại có thể thực hiện được một các dễ dàng. Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử đã làm được những bước tiến nhảy vọt trong mọi lãnh vực. Vậy có thể nói không ngoa là PCR đã thực sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử. Có thể xin đơn cử ra đây một số ví dụ :

PCR với kỹ thuật clone tái tổ hợp (cloning of recombinant)

            Nếu trước đây, muốn đưa một đoạn gene vào plasmid để chuyển thể plasmid này vào một vi khuẩn thì công việc này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức. Trước hết là phải có một số lượng tế bào đích để từ đó người ta ly trích toàn bộ bộ gene (genomic DNA). Sau đó dùng nhiều loại restriction enzyme để cắt bộ gene thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau, điện di trên thạch, làm kỹ thuật  Southern blotting và phát thiện đoạn gen muốn tìm bằng kỹ thuật lai (hybridization) với đoạn dò (probe) đặc hiệu. Trên kết quả đó, có thể định vị và trích được đoạn gen muốn tìm từ bản thạch đã điện di để gắn vào plasmid rồi đưa vào vi khuẩn mang. Tuy nhiên công việc như vậy cũng chưa đã hoàn tất, vì chưa chắc chúng ta đã gắn đúng đoạn gen mong muốn vào plasmid vì trên bản thạch chúng ta không thể chỉ lấy đúng đoạn gen đã định vị mà không lẫn các đoạn gene khác. Do vậy, phải chọn đúng vi khuẩn mang plasmid có gene mong muốn. Chúng ta gọi toàn bộ kỹ thuật này là clone tái tổ hợp, có khi phải thực hiện trong nhiều tháng, thậm chí nhiều năm, mà nhiều khi chưa chắc đã thành công. Ngày nay, nhà nghiên cứu có thể dùng kỹ thuật PCR trong thí nghiệm này. Trước hết là từ một vài tế bào đích ban đầu (không cần phải có nhiều tế bào đích  như kỹ thuật cũ), có thể sử dụng cặp mồi đặc hiệu để tổng hợp và khuếch đại đoạn gen muốn tìm thành hàng tỷ bản sao giống hệt nhau rồi đưa vào plasmid (không cần phải dùng một lượng lớn tế bào đích để ly trích được bộ gene và phân tích bằng restriction enzyme, rồi Southern blotting,.) Lúc này plasmid mang đúng đoạn gen đích, không thể có lẫn lộn các đoạn gene khác, vì vậy sau khi chuyển thể plasmid vào vi khuẩn mang, không cần phải làm kỹ thuật chọn dòng nữa. Như vậy chúng ta thấy cũng cùng một mục đích, nhưng với PCR, công việc đã gòn lại rất nhiều, có thể chỉ trong vòng vài tuần là xong.

PCR với kỹ thuật ly trích các đoạn DNA mong muốn

            Với các kỹ thuật sinh học phân tử king điển, để ly trích được một đoạn DNA mong muốn nào đó, nhà nghiên cứu phải có trong tay một số lượng khá các tế bào đích, để ly trích được bộ gene của tế bào. Sau đó từ bộ gene phức tạp này, ly trích đoạn DNA muốn tìm bằng hàng loạt các kỹ thuật sinh học phân tử phức tạp, tốn thời gian và công sức như đã nói trong phần trên.

            Với kỹ thuật PCR, công việc được giải quyết một cách gọn gàng hơn nhiều. Chỉ cần một số lượng nhỏ bộ gene có trong mẫu thử, với một cặp mồi đặc hiệu, có thể tổng hợp và khuyếch đại đoạn DNA đích trong bộ gen phức tạp thành hàng tỷ bản sao các đoạn DNA giống hệt nhau mà không cần phải làm động tác ly trích trở lại (hình 2).

                 Bộ gene phức tạp và cặp mồi  đặc hiệu              đoạn DNA mong muốn

Hình 2 : Ly trích đoạn DNA mong muốn bằng kỹ thuật PCR

            Một trường hợp khác là nếu đoạn gen mong muốn đã được  một nhà sinh học phân tử nghiên cứu trước đó và đã được gắn vào một plasmid, chuyển thể vào một loại vi khuẩn mang. Nếu một nhà sinh hóa học khác muốn có đoạn gene để nghiên cứu thì phải xin tác giả của nó gởi cho mình vi khuẩn mang với plasmid có gắn đoạn gen trên. Công việc này được gọi là "cloning by phoning". Tuy đơn giản hơn là phải ly trích ngay từ đầu đoạn gen trên, nhưng cũng tốn khá nhiều thì giờ chờ đợi sự chấp thuận của tác giả, chờ thời gian để chủng vi khuẩn mang được gởi đến. Với PCR thì công việc lại đơn giản hơn gấp nhiều lần, nhà nghiên cứu chỉ cần có đoạn mồi cho gen mong muốn, rồi dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen này thành hàng tỷ bản copy giống hệt nhau. Thế là có tha hồ rất nhiều đoạn gen mong muốn, rất thuần khiết, để làm nghiên cứu mà chẳng cần phải chờ đợi, phải xin phép tác giả,..

            Từ cấu trúc của protein với thứ tự các amino acid, nhà sinh học phân tử có thể suy ra được cấu trúc của đoạn mồi cần tổng hợp để khuyếch đại được đoạn gene chịu trách nhiệm trong tổng hợp protein trên. Ngoài ra, nhờ kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transciptate PCR), nhà sinh học phân tử có thể dễ dàng khuếch đại mRNA, nhờ vậy có thể nghiên cứu được sự biểu hiện gene mà không cần phải sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trước đây như ly trích mRNA từ một số lượng tế bào đích khá lớn rồi phát hiện nó bằng kỹ thuật Northern blotting. Phát hiện mRNA còn có một ứng dụng khác nữa là phát hiện xem vi sinh vật gây bệnh có kháng được với hóa trị liệu hay không, vì chỉ có vi khuẩn còn hoạt động mới tổng hợp được mRNA, nếu vi khuẩn đã chết thì khó phát hiện được  mRNAse vì cấu trúc này không bền dễ bị huỷ

bởi các men RNAse   vốn dĩ rất bền và hiện diện sẳn trong môi trường.

PCR Trong Phát Hiện Các Vi Sinh Vật Gây Bệnh

            Bằng các khuếch đạiđoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCRcó thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cảm cực cao mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được[1]. Sở dĩ được như vậy vì chỉ cần dưới 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là cóhiện diện nucleic acid đích và được PCR khuếch đại.

            Trong các thử nghiệm huyết thanh hay miễn dịch học, chìa khoá chính của thử nghiệm là có được trong tay các kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu. Nếu không muốn  mua sản phẩm thương mại, nhà miễn dịch học phải tự  chế và đây là một công việc rất công phu và tốn thời gian. Trong khi đó với PCR, chìa khóa chính của thử nghiệm là vấn đề tìm cho được các đoạn mồi đặc hiệu. Mà đây chỉ là một trò chơi trước máy vi tính : Với một CD room có đầy đủ các dữ liệu về thư viện DNA của các vi sinh vật mà các nhà nghiên cứu trước đã nghiên cứu được và với một phần mền chuyên dùng, một nhà vi sinh học hay sinh học phân tử có thể tự chọn những cặp mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau đó chỉ cần viết thư đặt hàng cho một hãng tổng hợp đoạn mồi theo đúng trình tự đã chọn. Sau khi tổng hợp xong, hãng sản xuất có thể gởi đến người sử dụng theo đường bưu điện mà không cần phải có điều kiện bảo quản chặt chẽ, vì các đoạn mồi sau khi tổng hợp xong, làm đông khô có thể giữ rất bền trong điều kiện bình thường. Công việc của nhà nghiên cứu lúc này là thử nghiệm xem các đoạn mồi được chọn có nhạy cảm và đặc hiệu như mong muốn hay không, nếu không thì lại chọn một cặp mồi khác,.

            Do thử nghiệm PCR quá nhạy cảm, nên khi áp dụng trong chẩn đoán, một vấn đề rất quan trọng cần phải lưu tâm, đó là hiện tượng dương tính giả, chủ yếu là do mẫu thử bị nhiễm bởi các sản phẩm PCR trước đó. Chỉ cần mẫu thử bị nhiễm một hoặc vài mãnh sản phẩm PCR thì các mãnh này sẽ được khuếch đại và mẫu cho kết quả dương nhưng là dương giả. Ðể  có thể tránh được kết quả dương giả, PCR chẩn đoán phải được thực hiện trong một phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ, các giai đoạn thí nghiệm phải được thực hiện tại những khu vực riêng, với các đồ dùng thí nghiệm riêng, sử dụng nhiều vật liệu chỉ dùng một lần (đầu pipette, ống nghiệm phản ứng, ống nghiệm sửa soạn bệnh phẩm,.) Ngoài ra còn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm. Hiện nay có lẽ hiệu quả nhất là sử dụng phương pháp nội tại loại trừ ngoại nhiễm : đó là trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng PCR men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra^[4]. Chính nhờ việc sử dụng UNG mà các thử nghiệm PCR chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh có thể thực hiện được tại bất cứ phòng thí nghiệm nào, không cần phải tại một thí nghiệm được thiết kế đặc biệt cho PCR chẩn đoán.

            Ngoài ra, PCR còn có một biến thể là kỹ thuật PCR tổ (Nested - PCR) có thể làm tăng thêm độ nhạy cảm của thử nghiệm một khi nucleic acid  đích hiện diện khá ít trong mẫu thử. Ðây là một kỹ thuật PCR hai giai đoạn : Giai đoạn đầu dùng một cặp mồi không đặc hiệu mấy để khuếch đại nucleic đích đến một số lượng nào đó đủ để vào giai đoạn kế, khuếch đại đoạn nucleic acid đích bằng cặp mồi đặc hiệu cao có vị trí bắt cặp nằm bên trong các đoạn nucleic acid được khuếch đại trong giai đoạn đầu.

            Với kỹ thuật RT-PCR, có thể khuếch đại nucleic đích là RNA, nhờ vậy có thể phát hiện tác nhân gây bệnh mà nucleic acid đích RNA (RNA của ribosome, mRNA, hay là RNA của virus), chứ không chỉ hạn chế với nucleic acid là DNA. Tuy nhiên cần phải lưu ý rằng kỹ thuật RT-PCR cũng như Nested - PCR là những kỹ thuật không thể dùng UNG là yếu tố nội tại chống ngoại nhiễm, vì vậy chỉ có thể thực hiện được trong những phòng thí nghiệm có tổ chức chặt chẽ.

            Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán bệnh nhiễm khuẩn là PCR chẳng những có thể phát hiện được tác nhân vi sinh vật gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm mà còn có thể phân loại type di truyền của các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn. Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng. Một chứng minh hết sức nỗi tiếng trong ứng dụng này là trường hợp "nha sĩ Florida" (Florida dentist) : Nhờ có PCR mà người ta đã xác định được 3 bệnh nhân khám điều trị răng đã bị nhiễm HIV từ một nguồn gốc là vị nha sĩ nọ bị nhiễm HIV. Ngoài ra PCR còn có thể phát hiện vi khuẩn kháng kháng sinh ví dụ phát hiện M. tuberculosis kháng rifampicin , một chìa khóa chủ yếu để bác sĩ điều trị có thể sử dụng phát đồ điều trị đúng cho bệnh nhân.

PCR với tiến hóa và khảo cổ học

            Từ năm 1963, các nhà nghiên cứu đã bắt đầu nghiên cứu về tiến hóa dựa trên cấu trúc phân tử của protein (cytochrome c, hemoglobin, ribonuclease,.) Sau đó họ bắt đầu nghiên cứu tập trung vào trình tự chuỗi của 16S RNA của ribosome trên vi khuẫn hay bộ gen của ty thể và lục lạp của thực vật. Ngày nay PCR đã góp phần làm công việc nghiên cứu về tiến hóa phân tử học trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Người ta có thể so sánh các loài với nhau bằng cách dùng các mồi đặc hiệu cho những vùng không đổi bộ gen, nhờ đó khuếch đại các vùng biến đổi, rồi so sánh với nhau. Ưu điểm vượt trội nhất của PCR trong lĩnh vực này là không cần mà chỉ cần một số lượng rất nhỏ mẫu vật là đủ để có thể tiến hành phân tích. Một ví dụ mà các nhà tiến hóa phân tử học đã thực hiện thành công là tìm hiểu được mối liên hệ giữa một loài gấu Bắc Mỹ và gấu Phi Châu. Họ chỉ cần đặt dọc trên đường đi của gấu, trên thân cây, những bàn cào để lấy được các dúm lông của gấu, rồi đem về phòng thí nghiệm phân tích. Nếu như trước kia là phải đặt những bẫy bắt được gấu, lấy một số lượng nhiều máu mới đủ để phân tích.

            Trong lĩnh vực khảo cổ học, nhờ DNA là một loại phân tử khá bền vững, có những mãnh DNA có thể tòn tại nguyên vẹn trong thời gian khá dài. Có rất nhiều truờng hợp những mãnh DNA cổ đại đã được PCR khuếch đại thành công, ví dụ người ta có thể khuếch đại DNA ty thể từ một người Châu Mỹ sống cách đây 7000 năm hay từ các mãnh xương của cọp răng chồn sống cách đây 14.000 năm.

PCR với phát hiện các khiếm khuyết gene

            Khiếm khuyết gene gây các bệnh di truyền hay ung thư là do bị đột biến đoạn hay điểm. Việc phát hiện các đột biến bằng phương pháp PCR là một điều hết sức dễ dàng khi mà đoạn DNA đặc hiệu đuợc khuếch đại lên có kích thước khác bình thường (do thêm hay mất đoạn). Với các trường hợp đột biến điểm, PCR hiện nay đã chiếm độc quyền trong lãnh vực này vì khả năng thực hiện các thí nghiệm tương đối đơn giản và ít tốn thời gian so các thử nghiệm sinh học phân tử không dùng PCR. Vì đọ dài của bài báo có hạn, chúng tôi không thể đăng tải hết một cách cụ thể các nguyên tắc riêng biệt, tuy nhiên tựu chung là người ta dùng PCR với các cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại  các đoạn DNA có chứa đột biến điểm rồi phân tích bằng các kỹ thuật sinh học phân tử khác ; hay dùng cặp primer chỉ khuếch đại đuợc đoạn DNA có đột biến điểm mà không khuếch đại được đoạn gene bình thường.

PCR và việc định type các mô

            Các mô được định type khác nhau dựa vào sự khác nhau về các kháng nguyên của phức hợp phù hợp tổ chức chính (MHC), ở người gọi là kháng nguyên HLA. Ðịnh type các mô là một việc hết sức cần thiết trong ngân hàng dữ liệu mô ghép và trước khi thực hiện phẫu thuật ghép mô hay cơ quan. Hiện nay định type các mô được dựa vào các phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên PCR cũng là một triển vọng đầy hứa hẹn trong lĩnh vựa này, vì định type các mô dựa vào PCR cho được nhiều thông tin hơn là các phương pháp miễn dịch học.

PCR và việc xác định các dấu ấn di truyền

            Dấu ấn di truyền được nói ở đây là những dấu ấn giúp phân biệt các cá thể trong cùng loài, xem có liên hệ với nhau hay không. Các dấu ấn này hoàn toàn không có ý nghĩa gì trong  việc biểu hiện kiểu hình thông qua tổng hợp protein.

            Trước đây, để phát hiện các dấu ấn di truyền, nhà nghiên cứu phải ly trích được bộ gene từ một khối lượng khá nhiều tế bào của cá thể cần khảo sát (mô, máu,..) sau đó cắt đoạn bộ gene này bằng các restriction enzyme, điện di trên thạch, làm Southern blotting, rồi dùng các đoạn dò đặc hiệu được đánh dấu để phát hiện. Kết quả là mỗi cá thể sẽ có một hình ảnh đặc trưng bằng các vạch được đánh dấu bằng các đoạn dò khi lai ghép trên Southern blotting. Người ta gọi kỹ thuật này là kỹ thuật phân tích sự đa hình về chiều dài của các mãnh DNA bị cắt đoạn, RFLP (Restriction Fragment Lengh Polymorphism).

            Với PCR, công việc trở nên đơn giản hơn rất nhiều. Có hai kiểu PCR phát hiện dấu ấn di truyền hiện đang được dùng. Kiểu thứ nhất là dùng PCR với các đoạn mồi nằm trước và sau các microsatellite, là các cấu trúc CACACA lặp đi lặp lại có rãi rác khoảng 100.000 lần trong bộ gene của động vật có vú và khuếch đại các microsatellite này. Vì các cá thể khác nhau có sự khác nhau về số lượng các cấu trúc CA tạo thành các microsatellite nên sau khi khuếch đại bằng PCR và phân tích các vạch trên thạch điện di, sẽ thấy các kiểu mẫu vạch khác nhau tùy từng cá thể được phân tích. Kiểu thứ hai gọi là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên các DNA đa hình (Random Amplified polymorphic DNA, RAPD) là dùng các đoạn mồi không đặc hiệu, thường ngắn khoảng 10 nucleic, cho bắt cặp với nucleic acid đích trong điều kiện bắt cặp không chặt chẽ, ở nhiệt độ khoảng 30-40 0C chẳng hạn. Nhờ vậy khi thực hiện PCR, sẽ có sản phẩm PCR là những đoạn DNA dài ngắn khác nhau do các đoạn mồi bắt cặp ngẫu nhiên trên DNA đích (ngẫu nhiên nhưng là tất nhiên, vì đoạn mồi sẽ bắt cặp trên chuỗi đích nào tương đối bổ sung nhất với nó) và các kích thước của những đoạn này sẽ được phát hiện trên thạch điện di. Sự giống và khác nhau về hình ảnh trên thạch điện di sẽ cho biết các cá thể đuợc phân tích có giống hay khác nhau, hay có liên hệ với nhau như thế nào ?

            Kỹ thuật PCR phát hiện dấu ấn di truyền đã có những đóng góp rất lớn trong khoa học hình sự. Chỉ cần tội phảm để lại trên hiện trường rất ít mẫu vật : Một vài giọt máy khô, vết tinh dịch, vài sợi lông hay tóc, hay thậm chí mẫu tàn thuốc có dính lại vài tế bào niêm mạc miệng, là các nhà sinh học phân tử có thể truy tìm được dấu ấn di truyền và phát hiện được ngay đúng tội phạm mà không thể nào chối cãi được. Một minh chứng khác cho áp dụng này là việc khám phá được bí mật của cái chết của cả gia đình Sa Hoàng Nicolas đệ II, được biết là đã bị hành quyết sau cách mạng tháng mười của Nga và xác của họ được chôn ở đâu đó. Gần đây theo lệnh của tổng thống Yeslin, địa điểm nghi ngờ chôn xác của họ đã được khai quật, và bằng kỹ thuật PCR dấu ấn di truyền so sánh với DNA của nữ hoàng Victoria Anh quốc, người ta đã khẳng định được một bộ xương là của hoàng hậu vì bà này là cháu gọi nữ hoàng Victoria  bằng dì. Một bộ xương khác được khẳng định là của Sa Hoàng vì so được với DNA từ mẫu xương của một quận công tổ tiên của Sa Hoàng. Riêng hoàng tử và công chúa thì không tìm thấy được. Theo một sĩ quan đã thi hành án thì xác hai vị này đã bị đốt cháy thành than sau khi xử. Tuy nhiên có một bà tên là Maria tự nhận mình là công chúa Natasia thì sao ? Trước đây không thể có một kỹ thuật di truyền nào có thể xác định được việc này và hiện nay thì bà Maria cũng đã qua đời. Các nhà nghiên cứu đã tìm ra được những bệnh viện mà trước đây bà Maria đã đến khám bệnh và điều trị và may mắn thay hãy còn tìm được những mẫu sinh thiết mô của Maria, thế là họ đã dùng kỹ thuật PCR dấu ấn di truyền và bây giờ đã có một trả lời rõ ràng : Maria không phải là công chúa Natasia.

PCR phát hiện đặc hiệu loài

                PCR còn có thể xác định loài bằng cách dùng các đoạn mồi đặc hiệu cho những vùng giống nhau gọi là các vùng lặp lại trực tiếp (direct repeat) hiện diện ở nhiều vị trí trong bộ gen, để khuếch đại các vùng thay đổi và phát hiện các vùng này. Nhờ vậy biết được các cá thể trong loài có giống hay khác nhau hay không. Kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật PCR lấy dấu ngón tay (PCR - finger printing), hay còn gọi là kỹ thuật PCR phát hiện các chuỗi giữa các vùng lặp lại IRS - PCR (Interpersed repeat sequence PCR). Trong bộ gen của người cũng có những đoạn lặp đi lặp lại, gọi là yếu tố Alu (Alu element). Cũng bằng kỹ thuật trên, các nhà nghiên cứu sinh học phân tử đã thực hiện được những áp dụng lớn, ví dụ khuếch đại các vùng thay đổi nằm xen giữa các Alu để lấy nguyên liệu di truyền ban đầu cho các khảo sát sau này.

PCR và kỹ thuật phát hiện trình tự chuỗi của một đoạn DNA (DNA sequencing)

            Trước đây, để làm DNA sequencing, người ta phải dùng kỹ thuật Maxam và Gilbert. Kỹ thuật này tương đối phức tạp mà tính lặp lại không cao. Hiện nay làm DNA sequencing bằng kỹ thuật PCR đơn giản hơn nhiều, kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật Sanger và rất được nhiều  phòng thí nghiệm sinh học phân tử hiện nay sử dụng. Nếu độc giả nào muốn tìm hiểu thêm thì có thể tham khảo tài liệu mà chúng tôi đã liệt kê^[2].

KẾT LUẬN

            Do các ứng dụng cực kỳ to lớn và kỳ diệu trong mọi lĩnh vực, PCR đã thật sự làm được một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử  trong thời điểm hiện nay. Với kỹ thuật và công nghệ ngày càng tiến bộ, các thuốc thử ngày càng rẽ hơn và tốt hơn, giá máy chu kỳ nhiệt ngày càng hạ và đặc biệt là việc sử dụng hệ thống nội tại chống ngoại nhiễm, thử nghiệm PCR không còn là một thử nghiệm quá cao cấp chỉ thực hiện được tại các phòng thí nghiệm hiện đại. Có thể nói PCR hiện nay hoàn toàn có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm trung bình tại các nước đang phát triển như chúng ta. Tuy nhiên, một khi muốn triển khai thử nghiệm PCR trong chẩn đoán một bệnh nào đó, chúng ta cần phải cân nhắc kỹ 5 chữ W  sau đây : Why, tại sao phải thực hiện PCR trong chẩn đoán bệnh đó ? Không nên làm nếu chúng ta đã có những thử nghiệm khác đơn giản và đủ nhạy cảm. When, khi nào chúng ta cần phải làm thử nghiệm PCR. Where, triển khai thử nghiệm PCR tại đâu ? Tại một phòng thí nghiệm mà ngay cả kỹ thuật đơn giản như nhuộm Gram một mẫu bệnh phẩm còn chưa làm được thì hoàn toàn không nên triển khai PCR. With, thử nghiệm PCR được thực hiện với ai, trên đối tượng nào ? Ðây chính là những kết luận mà chúng tôi muốn nhấn mạnh khi chấm dứt bài viết này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      DAVID H. PERSING ET AL. (1993). Diagnostic molecular Microbiology. Principles and applications. American Society for Microbiology. pp 51-172.

2.      JAMES D. WATSON ET AL. (1992) Recombinant DNA. Scientific American Books. Second edition. Pp 63-97.

3.      M. J. MCPHERSON ET AL. (1991). PCR a practical approach. The practical approach series. IRL press. pp 1-26.

4. MARTIN HEINRICH 91991). PCR carry over. Biotech Forum Europe . October 1991 : 594-597