ĐẶT VẤN ĐỀ
Carotenoid là nhóm sắc
tố có khả năng chống oxi hóa hữu hiệu,
được t́m thấy nhiều nơi trong tự nhiên
nhất là trong các sinh vật sống bao gồm thực vật,
động vật, vi khuẩn, tảo, nấm... Kể từ
khi được phát hiện cho đến nay, carotenoid
được ứng dụng rộng răi làm chất phụ
gia tạo màu cho thực phẩm và thức ăn cho động
vật, chất bổ sung giúp gia tăng giá trị dinh
dưỡng và thẩm mỹ cho tôm, cá,…. Bên cạnh đó,
nhiều nghiên cứu gần đây đă chứng minh các
carotenoid với vai tṛ là chất chống oxi hóa đă mang lại
lợi ích cho sức khỏe con người bằng cách
ngăn ngừa hay tŕ hoăn các bệnh măn tính như ung
thư, xơ cứng động mạch, đục thủy
tinh thể và một số bệnh khác. Do đó, carotenoid
cũng đă được nghiên cứu và ứng dụng
rất nhiều trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm.
(5,6,8,9)
Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn
trong tự nhiên được cho là an toàn hơn v́ ít tạo
ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe con người
so với từ con đường tổng hợp hóa học.
Ngoài ra, các yếu tố kinh tế khác như rẻ tiền,
năng suất cao cũng làm cho việc sản xuất
carotenoid từ nguồn tự nhiên ngày càng được
ưu tiên. Nguồn vi khuẩn sinh carotenoid phân bố rộng
răi trong tự nhiên. Việc sử dụng vi khuẩn có nhiều
ưu thế như dễ nuôi cấy ở qui mô lớn,
tăng trưởng nhanh và sử dụng cơ chất rẻ
tiền. Ngoài ra, việc sử dụng vi khuẩn sinh
carotenoid làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức
năng có thể đem đến những giá trị cao
hơn như gia tăng độ bền trong hệ tiêu
hóa, tính ổn định trong bảo quản. (2,10,12)
Hiện nay, có rất nhiều loài vi khuẩn sinh
carotenoid được phân lập từ nguồn nước
biển, suối nước nóng, vùng núi lửa, vùng có phóng
xạ,… như các loài thuộc chi Micrococcus, Corynebacterium,
Bacillus, Rhodococcus, … cho thấy tiềm năng to lớn của
việc sử dụng các chủng vi khuẩn này trong sản
xuất carotenoid. (3,7)
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật
liệu
Môi trường: TSA, TSB, MHA, DSM, môi trường
chứa casein, lipase, gelatin, tinh bột
Hoá chất
- Cho test DPPH: chloroform, methanol
(Merck), DPPH (2,2-diphenyl-1 picrylhydrazyl) (Merck), vitamin C, BHT
(2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol), β-caroten (Merck)
- Cho giải tŕnh tự 16S
rDNA: đệm ly giải Bacillus, lysozyme, N-laurylsarcosine 20%,
PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcol) (25: 24: 1), natri acetat 3M, ethanol
95%, ethanol 70%, đệm TE, đệm TAE 1X, Agarose (Merck),
ethidium bromide, PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase
(BioLabs), nước cất hai lần tiệt trùng, dung dịch nạp mẫu 10X,
kit tinh chế sản phẩm PCR (Wizard SV gel & PCR clean-up
system) (Promega).
Thiết bị: máy đo UV-vis Hitachi 2010, máy đông khô Christ, máy PCR, tủ ấm Shellab, kính hiển vi, máy lắc và các dụng cụ cần thiết khác
Thu mẫu và phân lập vi
khuẩn từ nguồn đất, nước
Các mẫu
đất, cát (khoảng 20g) được thu thập từ
biển và hồ tôm đựng trong ống Falcon 50 ml vô
trùng, cho nước vào đến vạch từ 30-40 ml,
phân tán đều mẫu. Hút 0,1 ml mẫu pha loăng với
dung dịch NaCl 0,85%. Nhỏ 100 μl mẫu ở 3 độ pha
loăng cuối lên TSA và trải đều. Ủ ở 37 oC
trong 24 đến 48 giờ.
Quan sát khóm có sắc tố vàng, đỏ cam, trích qua một
hộp thạch dinh dưỡng mới. Phân lập và kiểm
tra các khóm sinh sắc tố. Nhuộm Gram, quan sát dưới
kính hiển vi xem màu sắc, h́nh dạng và cách sắp xếp.
Tiến hành phân lập tiếp theo trên môi trường DSM
để khảo sát sự tạo bào tử. (4)
Chiết xuất và
sàng lọc hoạt tính chống oxi hoá
Chiết xuất: Nuôi cấy chủng vi khuẩn
trong 200 ml TSB, ở 37oC, 24 giờ. Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn và
đông khô. Dùng khoảng
300 mg sinh khối và tiến hành chiết xuất bằng 2,5
ml methanol và 5 ml chloroform. Ủ trong nước đá
trong 20 phút để
tránh sự huỷ hoại carotenoid. Sau đó,
thêm 2,5 ml nước
vào và vortex trong 30 giây. Đem ly tâm hỗn dịch này trong 5 phút ở tốc
độ 13000 ṿng/phút. Lớp dưới có màu sẽ
được thu lại và cho bay hơi hết chloroform. Lưu trữ dịch này ở -20oC
và tránh ánh sáng để thực hiện thử nghiệm
DPPH. (4,11)
Thử nghiệm DPPH: Dùng 1 ml dịch chiết
(pha loăng để có độ hấp thu trong khoảng
0,3-0,5) cho vào 2 ml dung dịch DPPH có nồng độ 10
μg/ml trong methanol. Hỗn hợp được lắc đều và
để ở nhiệt độ pḥng. Đo độ hấp thu sau 60
phút ở bước sóng 517 nm, mỗi mẫu đo 3 lần lấy giá trị
trung b́nh. Mẫu đối chiếu
là mẫu chỉ có DPPH bao gồm 2 ml DPPH và 1 ml methanol để
đảm bảo độ pha loăng.
Các chất so sánh được tiến
hành trong cùng điều kiện bao gồm
các chất chống oxi hóa như vitamin C, BHT
nồng độ
10 μg/ml trong methanol và β-caroten nồng độ 10 μg/ml
trong hỗn ḥa
methanol và chloroform (1:1). (1,5)
Khả năng đánh bắt gốc tự do (S%)
được tính theo công thức sau:
S(%)
= 100 x
(1 – )
Act
Ast
: Độ hấp thu của mẫu thử ở thời
điểm t = 60 phút.
Act
: Độ hấp thu của mẫu đối chiếu ở
thời điểm
t = 60 phút.
Định
danh với giải tŕnh tự 16S rDNA
Tiến hành chiết tách DNA theo quy tŕnh và khuếch đại sản phẩm bằng PCR với hai mồi P1 [5'-GCGGCGTGCCTAATACATGC-3 (mồi xuôi từ 40
đến 59) và P2 [5'-CACCTTCCGATACGGCTACC-3’] (mồi ngược
từ 1532 đến 1513). (4)
Việc giải
tŕnh tự gen 16S rADN được tiến hành bởi dịch
vụ của công ty Macrogen (Hàn Quốc), mỗi mẫu
được định tŕnh tự với 2 phản ứng dùng
mồi P1 và P2. Tŕnh tự thu được từ hai phản
ứng được lắp ráp lại bằng
chương tŕnh SeqMan trong bộ phần mềm Lasergene 7.0,
đối chiếu kết quả lắp ráp với dữ
liệu giải tŕnh tự ABI để xác định các
nucleotid chưa rơ, khoảng 100 nucleotid ở hai đầu được
loại bỏ do tín hiệu không rơ. Tŕnh tự gen đă lắp ráp được so
sánh bởi chương tŕnh NCBI BLAST với các ADN của GenBank.
Kết quả được chọn là kết quả có
Max Ident và Querry coverage cao nhất.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thu
mẫu và phân lập vi khuẩn từ nguồn đất,
nước
Từ 200 mẫu
đất và nước thu được từ biển
và hồ nuôi tôm, sau khi thực hiện phân lập trên môi
trường TSA đă thu được
54 chủng vi khuẩn tạo khóm có nhiều màu sắc khác
nhau trong đó chiếm
đa số là các
khóm có màu vàng và cam với các sắc đậm, nhạt khác
nhau.
H́nh 1. Các chủng phân lập được
trên môi trường TSA
Chiết xuất và sàng lọc
hoạt tính chống oxi hoá
Tính ổn định của DPPH (10
μg/ml) theo thời
gian sẽ được khảo sát trước hết với
kết quả được tŕnh bày theo bảng 1
Bảng 1. Tính ổn định của DPPH theo thời gian
|
Phút |
0 |
5 |
15 |
30 |
60 |
100 |
150 |
180 |
240 |
|
A |
0,33 |
0,30 |
0,33 |
0,33 |
0,33 |
0,32 |
0,31 |
0,31 |
0,31 |
H́nh 2. Phổ UV-vis và đồ thị khảo sát tính ổn
định của DPPH
Kết quả trên cho thấy DPPH có đỉnh
hấp thu ở bước sóng 517 nm và mặc dù độ
hấp thu có giảm nhưng được
chấp nhận là ổn định trong thời gian từ
0 đến 240 phút (p=0,81; α=95%).
Kết quả thực
hiện phản ứng DPPH
Kết quả trên 54 dịch chiết hữu
cơ thực
hiện phản ứng DPPH chúng tôi nhận thấy có 5 dịch
chiết có hoạt tính chống oxi hoá trung b́nh trên 50%.
Bảng
2. Kết quả thực hiện phản
ứng DPPH
|
Chủng |
S60 (% ) |
TB |
||
|
Lần 1 |
Lần 2 |
Lần 3 |
||
|
34 |
51,34 |
48,16 |
55,67 |
51,72 |
|
36 |
89,73 |
87,43 |
79,89 |
85,68 |
|
42 |
77,63 |
79,93 |
73,16 |
76,90 |
|
46 |
66,42 |
67,87 |
77,15 |
70,48 |
|
47 |
51,34 |
54,45 |
61,33 |
55,71 |
Kết quả quét
phổ UV-Vis
Kết quả UV-vis cho thấy 5 dịch
chiết này đều có nhiều hơn một đỉnh hấp
thu trong vùng
H́nh 3. Kết quả phổ UV-vis các dịch chiết hữu cơ
Định danh bằng
giải tŕnh tự 16S rDNA
Chúng tôi chọn
phương pháp khuếch đại gen 16S rDNA để định danh
5 chủng vi khuẩn này v́ đây là phương pháp cho kết quả chính xác. Tuy nhiên, các chủng được
chọn chỉ được định danh là gần nhất
với loài nào chứ không kết luận tên loài của các
chủng này hoàn toàn.
Chúng tôi dùng phần mềm Seqman để
ghép 2 tŕnh tự được giải với 2 mồi P1
và P2 để có được đoạn DNA hoàn chỉnh và
đưa tŕnh tự
này vào NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov
/blast/Blast.cgi)
để so sánh đoạn DNA của các chủng chọn lọc với
các chủng trong ngân hàng này. Kết quả được
tŕnh bày trong Bảng 3.
Bảng
3. Kết quả định danh với
NCBI BLAST
|
Chủng |
Loài gần nhất |
Query coverage *(%) |
Max ident **(%) |
|
34 |
Bacillus firmus |
100 |
99 |
|
36 |
Bacillus indicus |
100 |
99 |
|
42 |
Bacillus alcalophilus |
99 |
99 |
|
46 |
Bacillus catenulatus |
99 |
97 |
|
47 |
Bacllus aquimaris |
99 |
98 |
* Query
coverage: phần trăm tŕnh tự
được dùng để so sánh với cơ sở
dữ liệu
** Max indent: phần trăm
tŕnh tự tương đồng với cơ sở dữ liệu
Kết quả cho thấy các chủng vi
khuẩn được định danh đều thuộc
chi Bacillus. Qua khảo sát dưới kính hiển vi cũng cho thấy h́nh ảnh
bào tử tạo thành, tuy nhiên sự tạo thành bào tử ở
các loài này ít và khá chậm so với các chủng Bacillus tạo
khóm không màu.
KẾT LUẬN
Chúng tôi đă phân lập 54 chủng vi khuẩn
từ nguồn đất, nước ở biển và các
hồ tôm. Qua thử nghiệm DPPH của các dịch chiết
hữu cơ từ
các chủng vi khuẩn, chúng tôi đă sàng lọc được 5
chủng vi khuẩn có hoạt tính chống oxi hóa cao (trên
50%). Chúng tôi cũng đă định danh 5 chủng
vi khuẩn trên là Bacillus bằng phương pháp giải
tŕnh tự gen 16S rDNA.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
9.
McNulty, H., R. F. Jacob, R. P.
Mason. (2008) Biologic activity of carotenoids related to distinct membrane
physicochemical interactions. Am J Cardiol. 101(10A): p. 20D-29D.
10.
Olson, J. A. (1999) Carotenoids and
human health. Arch Latinoam Nutr. 49(3 Suppl 1): p. 7S-11S.
11.
R.
Khaneja, L. Perez-Fons, S. Fakhry, et al. (2009) Carotenoids found in
Bacillus. Journal of Applied Microbiology. 9999(9999).
12.
Rodriguez-Villalon, A., J. Perez-Gil,
M. Rodriguez-Concepcion. (2008) Carotenoid accumulation in bacteria with
enhanced supply of isoprenoid precursors by upregulation of exogenous or
endogenous pathways. J Biotechnol. 135(1): p. 78-84.