ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Việt nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.
Araliaceae) là một loài Panax mới, cho đến nay chỉ mới phát hiện ở Việt nam. Cây sâm này
được phát hiện vào năm 1973 tại đỉnh
Ngọc Linh, thuộc Khu 5 cũ nên c̣n được gọi
là sâm Ngọc linh hay sâm Khu 5. Đây là cây “thuốc giấu“
rất quư của dân tộc Sê Đăng sống trên dăy
Trường sơn với tác dụng tăng lực, chống
mệt mỏi khi đi rừng, lao động và nhiều
bệnh tật khác.
Cho đến nay đă có rất nhiều
công tŕnh nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Sâm Việt
Nhân sâm
được biết đến với hai dạng dùng chủ
yếu là Bạch sâm và hồng sâm. Hồng sâm được
dùng phổ biến hơn v́ sau khi chế biến thành phần
hóa học thay đổi làm hồng sâm có thêm tác dụng
bổ dưỡng, làm tăng thể lực, trí lực, chữa
bệnh tim mạch, thần kinh suy nhược, bệnh tiểu
đường, và đặc biệt hơn là tác dụng
pḥng chống ung thư, kháng viêm và chống oxy hóa…(3,4). Ngoài ra hồng sâm c̣n có những
ginsenosid mới không có trong bạch sâm như ginsenosid-Rg3,
G-Rg5, G-Rg6, G-Rh2, G-Rh3, G-Rh4,
G-Rs3…. Các thành phần mới này giúp tăng cường
hoạt tính sinh học của hồng sâm với tác dụng
pḥng chống ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa… Trong đó,
tinh chất G-Rg3 và G-Rh2 đă được
nghiên cứu phát triển như một thuốc chống
ung thư. Hiện nay, sâm Việt
Trên cơ sở
các vấn đề đă nêu ra chúng tôi tiến hành đề
tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của quá
trình chế biến lên sự thay đổi
thành phần hóa học saponin và tác
dụng tăng lực của Sâm Việt nam” nhằm
góp phần nâng cao giá trị điều trị và kinh tế
của nguồn sâm quư Việt nam.
ĐỐI
TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Thân rễ
và rễ củ sâm Việt
Phương pháp nghiên cứu
Chế
biến dược liệu
Thân củ và rễ củ sâm Việt
Mẫu sâm
tươi (R0) được đem sấy ở nhiệt
độ 50oC đến khi đạt độ ẩm
quy định cho dược liệu khô theo tiêu chuẩn
DĐVN III(không quá 13%).
Mẫu sâm để chế biến được chia thành các phần đem hấp ở 100oC trong các khoảng thời gian 2, 4, 6 và 8 giờ lấn lượt được đánh số S1, S2, S3 và S4. Sau đó các mẫu sâm đă hấp được đem sấy ở nhiệt độ 50oC cho đến khi đạt độ ẩm dưới 13%.
Chiết
saponin toàn phần
Các mẫu sâm được cắt lát và chiết
bằng thiết bị chiết Soxhlet với dung môi là
methanol 100% để thu lấy cao toàn phần.
Cao toàn phần được phân tách bằng cột pha đảo Diaion HP-20 với các dung môi rửa giải lần lượt là nước, methanol 100%, cloroform.
Dịch methanol 100%
được cô quay thu hồi dung môi và sấy khô
trong tủ sấy chân không thu được
cắn saponin toàn phần.
Phân
tích bằng sắc ký lớp mỏng
Mẫu cao saponin toàn phần
được ḥa trong dung môi MeOH và được chấm
với cùng một lượng mẫu trên bảng mỏng
silicagel, sử dụng hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O
(65:35:10; lớp dưới).
Phân
tích bằng sắc kư lỏng hiệu năng cao
Thực hiện
chạy mẫu HPLC trên máy sắc kư lỏng hiệu năng
cao Waters, detector PDA. Cột HPLC pha đảo: Sunfire C18 250 mm
x 4,6 mm, 5 µm. Sử dụng hệ dung môi gradient acetonitril
(A) và nước (B) theo tỉ lệ: 0–10 phút:
15% A, 85% B; 11–20 phút: 15%–25% A, 85%–75% B; 21–30 phút: 25%–35%
A, 75%–65% B; 31–40 phút: 35%–40% A, 65%–60% B; 41–50 phút: 40%–45%
A, 60%–55% B; 51–60 phút: 45%–50% A, 55%–50% B; 61–70 phút: 50%–25%
A, 50%–75% B; 71–85 phút: 25%–15% A, 75%–85% B. Cân mẫu chính xác với
khối lượng bằng nhau và ḥa tan trong pha động,
lọc mẫu với màng lọc kích thước 0,45 mm
trước khi bơm. Thể tích mỗi lân bơm là 20 ml,
tốc độ dòng 1,0 ml/phút, phát hiện
ở bước sóng 206 nm.
Thử
nghiệm dược lý
Súc vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực (chủng
Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung
b́nh 20 ± 2 g) được cung cấp bởi viện Pasteur
Nha Trang và được để ổn định ít nhất
một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột
được nuôi trong các lồng nhựa có kích thước
22x34x25 cm, mỗi lồng 5-6 chuột. Chuột
được nuôi đầy đủ bằng thức
ăn: thực phẩm viên được cung cấp bởi
viện Pasteur Nha Trang có bổ sung thêm giá đậu, rau xà
lách, nước uống.
Thể tích cho uống hoặc tiêm là 10 ml/kg thể trọng chuột. Thời gian cho chuột uống thuốc ở các thử nghiệm khoảng 8 - 9 giờ sáng. Riêng thử nghiệm tăng lực, chuột được cho uống thuốc 60 phút trước khi cho bơi. Tất cả các thử nghiệm được tiến hành từ 9 giờ sáng đến 16 giờ chiều.
Khảo sát tác dụng tăng lực, sức dẻo
dai và bền bỉ
Nghiệm pháp chuột bơi kiệt sức
Brekhman
Mô h́nh
được mô tả bởi Brekhman năm 1969 và gần
đây được mô tả bởi rất nhiều tác
giả khác (4,5).
Chuẩn bị
Sau thời gian để ổn
định, chuột được cho tập bơi 3 lần,
mỗi lần 15 phút và cách nhau 2 ngày. Sau mỗi lần tập
xong, chuột được cho sưởi khô dưới
đèn 100 W đến khô hoàn toàn, th́ trả chuột về
lại lồng.
Thử nghiệm
Chuột được mang
vào đuôi một gia trọng bằng 7% thể trọng của
nó và được cho bơi trong một bể bơi nhựa
có kích thước 28x46x29 cm, chiều cao của cột
nước 26 cm, nhiệt độ nước là 29±1oC.
Chuột được
cho bơi lần 1, thời gian bơi được tính từ
lúc chuột được thả vào bể bơi, chuột
bơi tự do cho đến mệt và ch́m xuống khỏi
mặt nước trong khoảng thời gian 7 giây mà không thể
trồi lên được nữa. Ngay lập
tức vớt chuột lên, cho sưởi ấm dưới
đèn cho đến khi phục hồi hoàn toàn. Thời gian
chuột bơi được ghi nhận lại nhờ 1
đồng hồ bấm giờ. Thời gian bơi lần
1 được kư hiệu là T0.
Cho chuột
nghỉ ngơi và tiến hành chia lô thí nghiệm. Chuột
được chia thành 4 lô với sự tương
đương về trọng lượng và thời gian
bơi lần 1 (T0):
Lô chứng:
được cho uống nước cất.
Lô
đối chiếu: được cho uống dung dịch
saponin Nhân sâm toàn phần với liều 20 mg/ kg chuột.
Lô thử
1: được cho uống cao saponin toàn phần của
sâm Việt
Lô thử
2: được cho uống cao saponin toàn phần của
sâm Việt
Sau khi nghỉ ngơi hồi phục hoàn
toàn, chuột bắt đầu được cho dùng thuốc.
Chuột trong mỗi lô được cho uống thuốc
với liều tương ứng. Sau khi uống thuốc
được 60 phút, chuột được cho bơi lần
2. Chuột cho uống nước cất và thuốc liên tục
đến ngày thứ 7 và 14 sau khi cho chuột uống thuốc
60 phút, tiến hành cho chuột bơi lần 3 và lần 4.
Lưu ư: để tránh dao động giá trị bơi th́ nên tiến hành thử nghiệm chuột bơi vào khoảng thời gian từ 11h đến 17h, đó là thời điểm mà sự chênh lệch về khả năng vận động của chuột là thấp nhất.
Đánh giá kết quả
So sánh diễn biến giữa các lô thí nghiệm.
So sánh
thời gian bơi giữa lô chứng và lô đối chiếu
với lô thử nghiệm 1 và 2 sau khi dùng thuốc, sau 7 ngày
và sau 14 ngày.
Trong mô h́nh này, không tính theo thời gian
bơi tuyệt đối của chuột mà tính thời
gian bơi của chuột sau khi dùng thuốc (T1, T7ngày,
T14ngày) gọi chung là Tt so với thời
gian bơi lần 1 (T0), theo công thức:
X% = (Tt / T0) x 100
Phân tích
kết quả và thống kê
Các số liệu được tŕnh bày là giá trị: TB ± SEM (Standard Error of mean, sai số chuẩn của giá trị trung b́nh). Việc thống kê các số liệu được sử dụng phần mềm thống kê SPSS ver. 13. Phân tích các số liệu bằng phép kiểm Kolmogorov-Smirnov cho thấy có sự phân bố không b́nh thường ở một số dăy số liệu. Do đó, sử dụng phép kiểm Kruskal-Wallis tiếp theo là phép kiểm Mann-Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô. Sự khác nhau được xem là có ư nghĩa khi giá trị p<0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân tích
bằng sắc ký lớp mỏng
Trên sắc
kư đồ của saponin toàn phần của các mẫu
sâm R0, S1, S2, S3 và S4 có đa số các vết giống
nhau về màu sắc và giá trị Rf. Tuy nhiên trên
sắc ký đồ xuất hiện một vết
mới (Rf = 0,64) với độ đậm
màu và kích thước các vết này tăng dần theo thời
gian hấp các mẫu sâm, chứng tỏ có sự thay đổi
về thành phần saponin trong quá tŕnh chế biến.
Hình 1. Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của R0 (1), S1 (2), S2 (3) , S3 (4) và S4 (5)
Kết
quả phân tích bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao
Khảo
sát sự thay đổi thành phần các
ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd trong dịch chiết saponin
toàn phần của các mẫu đo dựa
vào thời gian lưu của hỗn hợp
các chuẩn này.
Hình 2. Sắc ký đồ saponin toàn phần của mẫu sâm Việt nam chưa chế biến R (A) và các mẫu sâm Việt nam đã qua chế biến (S1:B, S2:C, S3:D, S4:E); 6 peak mới X, Y, Z, T, U, V và G-Rg1 (ginsenosid Rg1), G-Rb1 (ginsenosid G-Rb1), G-Rd (ginsenosid G-Rd).
Sắc ký đồ HPLC của mẫu sâm Việt nam đã qua chế biến và chưa chế biến cho thấy có sự khác nhau. Sau khi được chế biến, các thành phần ginsenosid chính như G-Rb1, G-Rd và G-Rg1 có trong mẫu sâm Việt nam chưa chế biến đã có sự thay đổi hàm lượng. Ngoài ra có một số lượng lớn các peak (ít nhất là 6) đã xuất hiện ở hai vùng chủ yếu: giữa 35 và 40 phút, và giữa 50 và 60 phút. Những peak này không có trong mẫu sâm chưa chế biến.
Có thể xem như 6
peak này dùng để phân biệt mẫu sâm
đã chế biến và chưa chế biến.
Thêm vào đó, có sự khác biệt
ở sắc ký đồ của các
mẫu sâm Việt nam đã chế biến khi
thời gian hấp tăng lên. Tuy nhiên, có sự
giảm hàm lượng của các peak chính
như ginsenosid-Rg1 và Rb1, điều này có
thể xem là các peak mới được
tạo thành là kết quả của sự
thủy phân từ các ginsenosid chính này. Trong
khi đó ginsenosid Rd lại giảm một cách
đáng kể ở mẫu sâm hấp 6 giờ
và không thay đổi ở mẫu sâm hấp 2
và 4 giờ.
Kết
quả thử nghiệm tác dụng tăng
lực của mẫu sâm đã chế biến
và chưa chế biến
Hình 3. Biểu đồ đánh giá
tác dụng tăng lực của cao saponin toàn phần của
sâm Việt
(1): Lô chứng (n =8) (2): Lô đối chiếu (n=6)
(3): Lô thử 1 (n = 7) (4): Lô thử 2 (n = 10)
(**): p < 0,01 so với lô chứng
(***):
p< 0,001 so với lô chứng
Dựa
vào kết quả thống kê và biểu đồ thể hiện
tác dụng tăng lực của sâm Việt Nam sau trước
và sau khi chế biến ta nhận thấy:
Lô
uống nước cất có thời gian bơi ở cả
4 lần không thay đổi.
Thời
gian bơi của từng chuột ở lần 3, 4 (T7ngày, T14ngày)
trong lô uống Nhân sâm và uống cao thuốc tăng có ư
nghĩa so với thời gian bơi lần 2(T1).
Lô
uống Nhân sâm có thời gian bơi tăng có ư nghĩa so với
lô uống nước cất.
Lô uống cao saponin toàn phần
sâm Việt Nam trước khi chế biến và sau khi chế
biến với liều 20 mg/kg làm thời gian bơi tăng có ư nghĩa so với lô uống
nước cất.
Lô uống
Nhân sâm có thời gian bơi không khác so với hai lô uống
cao saponin toàn phần sâm Việt Nam trước khi chế
biến và sau khi chế biến.
Đánh giá độc tính
cấp
Trong thử nghiệm độc
tính cấp, liều saponin toàn phần sâm Việt Nam
trước khi chế biến và sâm Việt Nam sau
khi chế biến (S4) cao nhất có thể cho chuột uống
là 4 g/kg chuột. Đây cũng là liều tối đa với
thể tích cho phép của cao thuốc có thể bơm cho chuột
thử nghiệm uống 1 lần. Cao saponin toàn phần của
sâm Việt Nam sau chế biến không thể hiện độc tính cấp
đường uống với liều tối đa có thể
cho chuột uống.
BÀN LUẬN
Từ kết
quả sắc kư đồ SKLM và HPLC có thể khẳng
định rằng qua quá tŕnh chế biến, thành phần
saponin trong sâm Việt Nam có sự thay đổi. Chất mới
có thể h́nh thành do sự thủy phân cắt đứt một
hay nhiều đơn vị đường của một
hay nhiều saponin đă biết có trong thành phần của
sâm Việt Nam. Dự đoán này được đưa
ra dựa trên cơ sở các nghiên cứu đă có về sâm
Triều Tiên, sâm Hoa Kỳ, tam thất được bào chế
theo kiểu Hồng sâm.
Từ kết quả thực nghiệm
cho thấy ngay cả ở liều thấp là 20 mg/kg chuột
đă có phát huy tác dụng làm kéo dài thời gian bơi ở
chuột nhắt. Như vậy, có thể xem cao saponin toàn
phần của sâm Việt Nam sau khi chế biến có tác dụng
tăng lực không thay đổi so với cao saponin toàn phần
của sâm Việt Nam chưa qua chế biến.
KẾT LUẬN
Sau
khi chế biến sâm Việt Nam đă có sự thay đổi
rơ rệt về thành phần hóa học saponin nhưng tác dụng tăng lực
của nó vẫn không hề suy giảm. Từ đó mở
ra một hướng nghiên cứu sâu rộng hơn về
các tác dụng dược lư khác cũng như
thành phần các chất mới tạo
thành để có thể khai thác thêm các giá trị trị
liệu khác của sâm Việt Nam sau khi chế biến một
cách toàn diện hơn nhằm góp phần phục vụ
chăm sóc sức khoẻ con người.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
Duc NM, Kasai R, Ohtani K, Ito A, Nham NT, Yamasaki K, Tanaka O (1994) Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha
et Grushv. collected in central
2.
Jung K, Kim
IH, Han D (2004) Effect of medicinal plant extracts on forced swimming capacity
in mice. J Ethnopharmacol, 93, 75-81.
4.