Nguyễn Thanh Thuận*,
Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát
Đông*
TÓM TẮT
Mở đầu: Nhân sâm được dùng trong
y học phương Đông hàng ngàn năm. Rễ của
nhân sâm có tác dụng tăng khả năng thích ứng của cơ thể,
tăng hiệu quả điều trị bệnh tiểu
dường type II, kích thích ham muốn t́nh dục, tăng
cường sức khỏe và điều trị tiểu
đường cũng như rối loạn t́nh dục ở
nam giới. Sâm thường được bán dưới
dạng rễ khô hay cắt lát. Các loại sâm khác nhau th́ hoạt
tính cũng khác nhau. Do đó cần một phương pháp
khoa học để xác định các loại sâm ở mức
phân tử.
Mục tiêu: Xây dựng các phương pháp
thuận tiện và có độ lặp lại cao để
xác định các loài sâm thuốc chi Panax và nguồn gốc
của chúng.
Phương
pháp: Chúng tôi dùng
phương pháp giải tŕnh tự, PCR-Restriction Fragment
Length Polymorphic (PCR-RFLP) trên vùng ITS và 18S, và Random Amplified Microsatellite (RAMS).
Kết quả: Phân tích tŕnh tự vùng ITS có thể
được dùng để xác định các loài sâm. Ngoài
ra, kỹ thuật RFLP có thể giúp phân biệt nguồn gốc
của chúng.
Kết luận: Các phương pháp phân tử đă sử dụng thích hợp
để xác định và phân biệt các mẫu sâm.
Từ khóa: PCR-RFLP, sâm, RAMS, di truyền
học.
ABSTRACT
AUTHENTICATION
OF GINSENG SPECIES BY BIOMOLECULAR METHODS
Nguyen
Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat
Dong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 1 - 2010: 129-133
Background: Ginseng has been used
in folk medicine for thousands of years. Its root is taken as adaptogens, aphrodisiacs,
nourishing stimulant and in the treatment of type II diabetes, as well as
sexual dysfunction in men. The root is most often available in dried form,
either whole or sliced. Different ginsengs have different active substances and
effects. Therefore, a scientific method of identifying ginseng cultivars at the
molecular level is required.
Objectives: To develop some convenient and reproducible
approaches for differentiation between Panax species and their sources.
Methods: Using sequence analysis, PCR-Restriction
Fragment Length Polymorphic (PCR-RFLP) with primers rDNA 18S and ITS, and
Random Amplified Microsatellite (RAMS).
Results: Sequence analysis of ITS region can be used
for identification at species level. RFLP method can differentiate the origin
of samples.
Conclusions: These methods were
useful for identifying and differentiation ginseng samples
Keywords: PCR-RFLP, gingseng, RAMS,
genetics
M Ở ĐẦU
Nhân sâm là một loại thuốc bổ, đóng
vai tṛ quan trọng trong việc dự pḥng và điều trị
những bệnh lư mạn tính, cần điều trị
dài ngày như bệnh tiểu đường, ung thư, bệnh
xơ vữa động mạch, huyết khối, cao lipid
máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn năo… do tác dụng
tăng cường thể lực và gia tăng sức tự
đề kháng không dặc hiệu của cơ thể, tác
dụng chống oxi hóa một cách trực tiếp hay gián tiếp.
Y học hiện đại đă chứng
minh Nhân sâm duy tŕ sự hằng định nội môi của
hệ thần kinh trung ương, hệ nội tiết và
hệ miễn dịch. Tuy các tác dụng trị liệu không điển h́nh, tương
đối yếu so với các thuốc đặc trị
Tây y nhưng việc ít gây tác dụng phụ khi sử dụng
dài ngày, nhất là ở những đối tượng
tượng bệnh nhân cao tuổi là ưu điểm của
Nhân sâm(1).
Một loạt kỹ thuật
sinh học phân tử đă được dùng để
nghiên cứu đa dạng di truyền của chi Panax
như random amplified polymorphism
DNA (RAPD)(11), amplified fragment length polymorphism (AFLP)(4), PCR-restriction fragment
length polymorphism (PCR-RFLP)(3), arbitrarily primed PCR (AP-PCR)
(10), direct amplification of
length polymorphism (DALP)(5), inter-simple sequence repeat
(ISSR)(6) và giải tŕnh tự(2).
Trong bộ gen thực vật, các gen RNA ribosome
(rDNA) được sắp xếp trong những đơn
vị lặp lại nối tiếp nhau với mỗi đơn vị gồm
18S rDNA-ITS1-5.8S rDNA-ITS2-26S rDNA. Vùng mă hóa của
ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn hai vùng ITS.
Một kỹ
thuật khác dựa trên PCR là random amplified microsatellite (RAMS).
Kỹ thuật RAMS là sự kết hợp đặc tính
phân tích RAPD và vùng vi vệ tinh. Bản
chất của kỹ thuật này là các dấu ấn
được phát hiện khi khuếch đại hai vùng vi vệ tinh ngẫu nhiên cùng với tŕnh tự
xen giữa hai vùng này. Phương pháp này có độ lặp
lại cao và cho phép phát hiện đa h́nh của DNA trong cùng
một loài hay giữa các loài(7).
VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP
Các mẫu sâm
Các mẫu sâm tươi hay khô được
thu mua từ các nguồn sau: các mẫu P. ginseng được mua ở
Việt Nam (Pg1, Pg2) và
Hàn Quốc (Pg3, Pg4); P. quinquefolius L. (Pq), P. notoginseng (Pn1, Pn2)
và P. vietnamensis (Pv) từ Việt Nam.
Tách chiết DNA.
Tách chiết DNA từ các mẫu Panax theo phương pháp của
Manian được biến đổi (9). Thành tế
bào được phá vỡ bằng cách làm lạnh trong
nitơ lỏng và nghiền mịn trong cối sứ.
Màng tế bào được phá vỡ bằng
cách ủ trong đệm chiết ở 65oC trong 30
phút. Sau đó, DNA được chiết bằng hỗn
hợp chloroform-isoamyl alcohol (24:1). Tủa DNA bằng
isopropanol và rửa bằng ethanol 70%. DNA được
ḥa tan lại trong 100ml TE.
Thực hiện
PCR-RFLP.
Vùng ITS được khuếch đại với
cặp mồi chung ITS_AF (5’- GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G -3’) và
ITS_BR (5’- CTT TTC CTC CGC TTA TTG ATA TG -3’) (8). Phản ứng PCR
được thực hiện với tổng thể tích
là 25ml
gồm 1mM/mồi
(IDT); 1U Taq polymerase (BioLabs);
0,4mM dNTP (BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM MgCl2 (BioLabs). Chu tŕnh phản ứng là 1 chu
kỳ: 94oC 5 phút; 30 chu kỳ: 94oC 30 giây, 45oC
1 phút, 72oC 1 phút; 1 chu kỳ: 72oC 7 phút.
Vùng 18S cũng được khuếch đại
với cặp mồi chung 18SCOM_F
(5’- TGC ATG GCC GTT CTT AGT TGG TGG -3’) và 18SCOM_R (5’- CAC CTA CGG AAA CCT
TGT TAC GAC -3’) (12).
Phản ứng PCR được thực hiện với tổng
thể tích là 25ml
gồm 0,4mM/mồi
(IDT); 1U Taq polymerase (BioLabs);
0,4mM dNTP (BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM MgCl2 (BioLabs). Chu tŕnh phản ứng là 94oC 5 phút / 35 chu
kỳ 94oC 30 giây, 52oC 30 giây, 72oC 1
phút / 72oC 7 phút.
Sản phẩm
PCR được tinh chế qua cột Promega Wizard® SV Gel
and PCR Clean-Up System và cắt bằng hỗn hợp
enzyme HaeIII và HindIII (BioLabs) trong 1 giờ ở 37oC. Sản
phẩm cắt được điện di trên gel
polyacrylamide 15%.
Giải tŕnh tự
Các sản phẩm
PCR được giải tŕnh tự bởi công ty Macrogen
(Hàn Quốc). Kết quả
được BLAST trên NCBI để t́m các tŕnh tự
tương đồng
Thực hiện RAMS
Các mồi cho phản ứng
RAMS: RAMS1 (ACA)5, RAMS2 (CCA)5, RAMS3 (CGA)5,
RAMS4 (GT)5G (7). Phản ứng PCR được thực hiện với
tổng thể tích là 25ml gồm 5ng DNA khuôn; 0,5mM/mồi (IDT); 1U Taq polymerase (BioLabs); 0,2mM dNTP
(BioLabs); 1X PCR buffer (BioLabs); 2mM MgCl2 (BioLabs). Chu tŕnh phản ứng là 95oC 5 phút
/ 35 chu kỳ gồm 95oC 30 giây;
38,5oC (RAMS1), 53oC (RAMS2), 53oC (RAMS3),
33,5oC (RAMS4) 45 giây; 72oC 2 phút / 72oC 7
phút. Sản phẩm PCR được điện
di trên gel agarose 1%.
Phân tích kết quả
Sản phẩm điện di được chụp
h́nh bằng máy Dolphin (Wealtec Corp.). Phân tích kết quả bằng
phần mềm BioNumerics 3.0 để tạo cây phát sinh loài
làm căn cứ phân biệt.
K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
PCR với cặp mồi ITS cho sản
phẩm có kích thước phù hợp với dự đoán
trong khoảng 750bp. Riêng các
mẫu Pg1 và Pg2 không cho sản phẩm. C̣n cặp mồi
18S cho sản phẩm khoảng 500bp nhưng mẫu Pn2 không
cho sản phẩm.
Kết quả giải tŕnh tự và BLAST trên NCBI cho thấy
các mẫu đều thuộc chi Panax. Tuy nhiên, kết
quả trên vùng 18S không thể phân biệt ở mức loài.
Điều này có thể là do sự bảo tồn cao của
vùng này giữa các loài có quan hệ gần. Dựa vào kết quả trên vùng ITS, chúng tôi có thể
xác định loài có quan hệ gần nhất với các mẫu
(bảng 1) nhưng không thể phân biệt nguồn gốc
của các mẫu.
Bảng 1. Kết quả
BLAST tŕnh tự vùng ITS trên NCBI
|
Mẫu
|
Loài
|
Query
coverage (%)
|
Max
ident (%)
|
|
Pq
|
Panax
quinquefolius
|
98
|
98
|
|
Pg3
|
Panax ginseng
|
98
|
99
|
|
Pg4
|
Panax ginseng
|
96
|
99
|
|
Pn1
|
Panax notoginseng
|
97
|
98
|
|
Pn2
|
Panax notoginseng
|
98
|
97
|
|
Pv
|
Panax quinquefolius
Panax vietnamensis
|
96
|
98
|
Mặc dù mẫu Pn1 và Pn2 là P. notoginseng, kết quả phân
tích RFLP trên vùng ITS cho thấy chúng có mức tương
đồng không đáng kể (dưới 50%). Nguyên
nhân có thể là do nguồn gốc, điều kiện sinh
trưởng, thổ nhưỡng khác nhau. Các mẫu Pq, Pg3 và Pg4 có mức tương đồng
cao, cho thấy chúng có quan hệ gần với nhau (h́nh 1,
2).
H́nh 1. Kết
quả RFLP vùng ITS. M: thang 100bp
H́nh 2. Kết quả
phân tích sự đa h́nh sản phẩm RFLP đoạn ITS
Phân tích RFLP trên vùng 18S cho thấy các mẫu
Pg3, Pg4 (thu mua từ Hàn Quốc) có mức
tương đồng cao hơn các mẫu Pg1, Pg2 (thu mua tại
Việt Nam)
khoảng 20% (h́nh 3, 4). Nh́n chung phân tích
RFLP trên vùng 18S cho kết quả tương đồng cao
hơn vùng ITS do vùng này được bảo tồn cao
hơn.
H́nh 3. Kết
quả RFLP vùng 18S. M: thang 100bp
H́nh 4. Kết quả
phân tích sự đa h́nh sản phẩm RFLP đoạn 18S
Thử nghiệm các mồi RAMS th́
chỉ có mồi RAMS1 cho sản phẩm khi phân tích trên gel.
Do đó, chúng tôi chọn mồi này cho các thử nghiệm
tiếp theo. Khảo sát nồng độ
MgCl2 cho thấy nồng độ MgCl2 ở
2mM cho kết quả PCR
rơ nhất.
Trên cơ sở các thông số như trên, chúng tôi tiến
hành RAMS trên các mẫu. Kết quả phân tích trên BioNumerics cho thấy các mẫu có mức đa
dạng thấp (dưới 15%). Điều
này là do kích cỡ mẫu thấp và chỉ có một mồi
được thử nghiệm (h́nh 5, 6).
H́nh
5. Kết quả PCR mồi RAMS1.
M: thang 1000bp
H́nh 6. Kết
quả phân tích đa h́nh sản phẩm khuếch đại
RAMS1.
Từ các kết
quả trên, chúng tôi nhận thấy để có thể kết
luận chính xác về loài và nguồn gốc của các mẫu
cần kết hợp nhiều phương pháp. Phân tích tŕnh tự vùng ITS có thể
giúp xác định loài của các mẫu. Ngoài ra, sự kết hợp giữa phân tích RFLP và
giải tŕnh tự có thể phân biệt nguồn gốc của
các mẫu này.
K ẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, các mẫu Panax sp. được
xác định loài và phân biệt nguồn gốc nhờ các
kỹ thuật sinh học phân tử. Nh́n chung,
các mẫu sâm thu mua từ Hàn Quốc có mức tương
đồng cao hơn các mẫu thu mua tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
Court, William E. (2000). Ginseng
: the genus panax. Medicinal and Aromatic Plants—Industrial Profiles,
ed. Roland Hardman. Vol. 15. Amsterdam:
Harwood Academic. ix,266p.
2.
Fushimi, H.,
K. Komatsu, M. Isobe, et al. (1996). 18S ribosomal RNA gene sequences of three
Panax species and the corresponding ginseng drugs. Biol Pharm Bull, 19(11): p.
1530-2.
3.
Fushimi, H.,
K. Komatsu, M. Isobe, et al. (1997). Application of PCR-RFLP and MASA analyses
on 18S ribosomal RNA gene sequence for the identification of three Ginseng
drugs. Biol Pharm Bull, 20(7): p. 765-9.
4.
Ha, W. Y., P. C. Shaw, J. Liu, et al. (2002). Authentication of Panax ginseng and Panax
quinquefolius using amplified fragment length polymorphism (AFLP) and directed
amplification of minisatellite region DNA (DAMD). J Agric Food Chem, 50(7): p.
1871-5.
5.
Ha, W. Y., F. C. Yau, P. P. But, et al. (2001). Direct amplification of length
polymorphism analysis differentiates Panax ginseng from P. quinquefolius. Planta Med, 67(6): p.
587-9.
6.
Hon, C. C., Y. C. Chow, F. Y. Zeng, et al. (2003). Genetic authentication of ginseng and
other traditional Chinese medicine. Acta Pharmacol Sin, 24(9): p. 841-6.
7.
Latiffah, Z., K. Harikrishna, S.G. Tan, et al. (2005). Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
and Random Amplified Microsatellite (RAMS) of Ganoderma from infected oil palm
and coconut stumps in Malaysia.
Asia Pacific Journal of Molecular Biology and
Biotechnology, 13(1): p. 23-34.
8.
Linder, C.
R., L. A. Moore, R. B. Jackson (2000). A universal molecular method for
identifying underground plant parts to species. Mol Ecol, 9(10): p. 1549-59.
9.
Manian, S., S. Sreenivasaprasad, P.R. Mills (2001). DNA extraction method for PCR in mycorrhizal
fungi. Letters in Applied Microbiology, 33(4): p. 307-310.
10.
Shaw, P. C.,
P. P. But (1995). Authentication of Panax species and their adulterants by
random-primed polymerase chain reaction. Planta Med, 61(5): p. 466-9.
11.
Um, J. Y., H. S. Chung, M. S. Kim, et al. (2001). Molecular authentication of Panax ginseng
species by RAPD analysis and PCR-RFLP. Biol Pharm Bull, 24(8): p. 872-5.
12.
Zhang, Huan,
Senjie Lin (2002). Detection and Quantification of Pfiesteria piscicida by Using the Mitochondrial Cytochrome b Gene. Appl. Environ. Microbiol., 68(2): p. 989-994.